模糊數學結合響應曲面法優化乳清蛋白凝膠工藝

趙紫微，潘道東，曾小群，王淑慧

（寧波大學海洋學院，浙江寧波315211）

乳清蛋白主要存在于工業生產干酪的副產品-乳清中，它是一種高營養的優質蛋白[1]。但是根據一些統計數據，每年大約有40%～50%的乳清被浪費；在這些乳清被浪費同時，大量的乳清蛋白也被浪費；因此對乳清蛋白的綜合利用也備受關注[2]。乳清蛋白不但含有許多生物活性物質，而且具備很高的代謝率，容易被消化；因而具有很高的生物利用價值和功能特性。

乳清蛋白溶液具備良好功能特性，比如膠凝性、溶解性等，所以它可以作為一種食品組分來賦予食品一些特殊的感官性質[3-5]。特別是近年來隨著消費者對低脂食品需求的升高，對脂肪替代品的開發和研究已經逐漸地引起了相關工作人員的重視，部分學者開始利用酶改性乳清蛋白來研究和開發脂肪替代品[6-8]。這其中采用最多的是利用地衣芽孢桿菌蛋白酶（BLP）和堿性蛋白酶（Alcalase2.4L）來誘導的蛋白質凝膠，但是目前關于酶誘導蛋白質凝膠的影響因素方面的研究報道相對較少。

本實驗選用中性蛋白酶對乳清蛋白進行水解，在適當條件下制備質構特性類似脂肪的凝膠。先在單因素實驗的基礎上研究了不同的參數如pH、溫度、酶與底物比、黃原膠對凝膠性質影響，然后進行了Box-Behnken實驗并利用模糊數學結合響應曲面法優化了誘導條件。對酶誘導蛋白質成膠的一些相關因素進行了研究和探討，為低脂食品的研究和開發提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清蛋白粉 寧波大學曹光彪科技樓127實驗室提供；中性蛋白酶 酶活力為100000U/g，寧夏夏盛實業集團有限公司；氯化鈣、黃原膠 國藥生物科技有限公司；參考奶油 市售；其余化學分析試劑 均為分析純。

PL403電子天平、FE-20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；DK-20電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；TA.XT.plus質構分析儀StableMicro System公司；NICOMP 380/ZLS納米粒度分析儀 美國PSS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 凝膠制備工藝參數的單因素實驗 為了探究各個工藝參數對所制備凝膠的性質影響，并為響應曲面優化實驗的各因素與水平的選擇提供依據[9]。分別選取體系pH、凝膠溫度、黃原膠添加量、酶與底物濃度比等4個因素進行單因素實驗。具體為：體系pH：考察體系pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0時的凝膠效果；凝膠溫度：考察凝膠溫度分別為35、40、45、50、55℃時的凝膠效果；黃原膠添加量：考察黃原膠添加量為0、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%時凝膠效果；酶與底物濃度比：分別觀察酶與底物濃度比為0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%時的凝膠效果；在考察單因素時，其他各因素的水平分別設定為：乳清蛋白質量濃度1g/10mL、氯化鈣添加量2mmol/L、反應pH7.0、反應溫度45℃、黃原膠添加量0.01%、酶與底物濃度比0.75%。

1.2.2 凝膠的質構分析 參照Charles[10]的方法略有改動，采用TA.XT.plus質構分析儀對樣品的質構進行分析。具體如下，先將凝膠樣品裝入直徑為45mm、高55mm的燒杯中，樣品高度為30mm，然后用25mm直徑的平底探頭對膠體進行擠壓測定。探頭的測試速度為1mm/s，下降距離為10mm。利用儀器自帶的軟件分析得到凝膠的相關質構參數：黏附性（取絕對值）、硬度、彈性。實驗測定每個指標重復3次，取平均值。

1.2.3 凝膠持水度的測定 凝膠的持水性計算公式如下所示[11]。準確稱取適量凝膠樣品置于10mL離心管中離心30min，轉速為4000r/min。

持水性（%）=（吸去水分后離心管質量（g）-離心管質量（g））/凝膠樣品質量（g）×100

表1 響應曲面實驗設計因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in response surface analysis

1.2.4 響應曲面實驗 依據Box-Behnken設計原理，采用Design-Expert 8.00軟件，選取體系pH、凝膠溫度、酶與底物濃度比這3個因素在3個水平上進行響應曲面實驗，其中響應值為凝膠的綜合素質得分。共計17組實驗，其中5個為中心點。

1.2.5 凝膠的綜合素質評定 根據凝膠樣品質量的指標內容，以及黏附性、硬度、彈性、持水度這四個因素對產品質量的重要程度的不同。先設定凝膠樣品質量指標集U和權重向量A，然后計算凝膠的綜合素質。凝膠質量指標集，其中u1、u2、u3、u4分別表示黏附性、硬度、彈性、持水度。

各因素的權重向量A=（a1，a2，a3，a4）=（0.3，0.3，0.3，0.1），并且a1+a2+a3+a4=1。

1.2.6 凝膠成品的粒徑分析 粒徑分布按Pan[12]所述方法進行測定，稱取適量的凝膠配成2%溶液后攪拌1h，轉速為200r/min，然后用粒徑分布儀進行測定。

1.2.7 統計分析 采用SPSS 16.0軟件分析各實驗因素對凝膠性質的影響，采用LSD值對一維線性方差進行顯著性分析，且當p＜0.05時為顯著。

2 結果與分析

2.1 工藝參數的單因素實驗

圖1 pH對凝膠時間和持水性，凝膠質構性質的影響Fig.1 Effect of pH on gelling time,water holding capacity，and textural properties of the gel

2.1.1 pH對凝膠效果的影響 由圖1可知，隨著pH逐漸升高，凝膠時間逐漸變長；持水性先上升后下降，在pH為7.5時達到最高（p＜0.05），為84.7%；同時，凝膠的黏附性、硬度和彈性都呈下降趨勢。這可能因為pH在6～8這個區間內，隨著體系的pH不斷變大，中性蛋白酶的活性逐漸變低，導致其對乳清蛋白酶解作用的功效降低；凝膠速度會變慢，其結構也會隨之變得更有規則，不會呈雜亂無章的聚集狀態，故而持水性變高、黏附性、硬度和彈性均降低[12]。但是，過高pH是會影響凝膠的色澤、降低其風味；況且太長凝膠時間也是不合適的。

2.1.2 凝膠溫度對凝膠效果的影響 由圖2可知，隨著溫度的升高，凝膠的硬度一直上升；而凝膠時間和凝膠的彈性都呈下降趨勢；凝膠的持水性和黏附性表現為先上升后下降，當溫度為45℃時兩者均達到最大值（p＜0.05），分別為85.6%和0.65。這表明隨著溫度的升高，中性蛋白酶的活性增強，對乳清蛋白的降解過程加快，進而凝膠時間變短。實驗過程中還發現，在45℃時形成的凝膠質地不但結構均勻細膩，顏色上也是充滿光澤。在45～55℃這個溫度區間內，由于溫度的持續上升可能導致了體系形成熱誘導凝膠，從而促使凝膠的硬度增大、彈性減小、黏附性開始下降。

圖2 凝膠溫度對凝膠時間和持水性，凝膠質構性質的影響Fig.2 Effect of temperature on gelling time，water holding capacity，and textural properties of the gel

2.1.3 黃原膠添加量對凝膠效果的影響 由圖3可知，隨著黃原膠添加量的增多，凝膠速度加快、凝膠時間變短；凝膠的持水性、硬度、粘附性、彈性都近似呈線性上升趨勢。這表明在0～0.02%范圍內，隨著黃原膠量的增多，凝膠的質構性質和持水性均向有利態勢發展。這可能與黃原膠的性質有關，黃原膠是一種水溶性高分子多糖。一方面，由于其分子量大，溶于水后會充分水化而束縛了大量的自由水；另一方面，它的大體積分子也會和介質發生相互作用，阻礙介質的自由移動。所以，體系的層流間就會產生阻力阻礙其流動性，因而體系的黏附性會升高[13]。但是黃原膠的添加量也不宜太多，在實驗過程中發現添加過多黃原膠后，凝膠的組織粗糙、質地堅硬，這對凝膠也是不利的。因此，黃原膠的量定為0.015%。

圖3 黃原膠添加量對凝膠時間和持水性，凝膠質構性質的影響Fig.3 Effect of xanthan gum on gelling time，water holding capacity，and textural properties of the gel

圖4 酶與底物濃度比對凝膠時間和持水性，凝膠質構性質的影響Fig.4 Effect of enzyme-to-substrate ratio on gelling time，water holding capacity，and textural properties of the gel

2.1.4 不同酶與底物濃度比對凝膠效果的影響 如圖4所示，隨著酶與底物濃度比的上升，凝膠時間、黏附性、硬度呈逐漸下降趨勢；凝膠彈性先下降后又上升，在酶與底物濃度比為1%時彈性最低（p＜0.05），為0.93；持水性呈波浪形變化趨勢，先升高后降低、然后又升高再降低。這表明隨著酶的含量上升，酶解反應速率加快，凝膠時間變短；一般來說，不斷加快的凝膠速度會導致凝膠結構變得不規則，呈現出雜亂無章的聚集狀態，凝膠的黏附性、硬度和彈性也會隨之上升[12]。但是在實驗中凝膠的黏附性、硬度均呈下降趨勢，持水性也呈特殊的變化趨勢、分別在0.5%和1.0%這兩個點達到較高值（p＜0.05）。這些特殊的凝膠性質可能是由于在成膠點時的水解程度、聚集顆粒的特性不同[14]。

2.2 凝膠樣品綜合素質評定結果

根據凝膠質量各個指標所占的權重不同，采用公式Y=A×U計算Box-Behnken實驗中17個實驗組的凝膠綜合素質。其中，每個實驗組的對應數據如下。

相應的Y1=（0.3，0.3，0.3，0.1）×，同理可得Y2，Y3，Y4，Y5·……Y17。

2.3 Box-Behnken實驗設計結果及數據方差分析

Box-Behnken實驗設計及結果如表2所示。對數據進行二元多次回歸分析，得到擬合方程為Y=0.1652A+ 0.02547B+0.5658C-0.0002AB-0.048AC-0.0098A2-0.000258B2-0.1592C2（其中BC項的系數為3.816×10-18，因此可以忽略不計），此時模型的p值為0.0239，小于0.05，即模型顯著；模型的Lack of Fit的p值為0.7318，大于0.05。這說明擬合方程的擬合效果良好，能夠滿足響應面分析的要求。

表2 Box-Behnken實驗結果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

根據表3，模型中只有A為極顯著、C2為顯著；其余項均不顯著；三個因素對凝膠效果的影響依次為A＞B＞C，相應的pH＞凝膠溫度＞酶與底物濃度比。

2.4 響應曲面分析

依據上面的分析，三個交互項均不顯著，說明三者之間都沒有相互的影響。圖5列出了響應面的三維圖。通過Design-Expert 8.00軟件分析得到凝膠綜合素質最高可達到0.721，此時的各因素的工藝條件為：pH6.5、凝膠溫度46.8℃、酶與底物濃度比0.8%。

表3 回歸模型系數顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for response surface reduced quadratic model

采用優化后的實驗條件進行重復實驗，為了方便，參數定為pH6.5、凝膠溫度47℃、酶與底物濃度比0.8%。最后所得Y值為0.720，與理論值0.721非常接近，可見所確定的模型能夠較好地預測實驗結果。

圖5 各相互因素對凝膠綜合得分影響的響應曲面圖Fig.5 Effect of two factors on Y value by response surface analysis

2.5 凝膠的各項指標

通過對參數分別為pH6.5、凝膠溫度47℃、酶與底物濃度比0.8%、黃原膠0.015%的凝膠的質構、持水性和粒徑分析可以得到，凝膠的黏附性、硬度、彈性分別為0.72N·S、0.35N、0.94，與參考奶油比較接近（見表4，其中參考奶油的質構值按1.2.2中所述方法測定）；持水度為83.3%，凝膠的平均粒徑為22.63μm。由于凝膠顆粒細小均勻，因此可以用來模擬脂肪。

表4 凝膠和參考奶油的質構值Table 4 Textural properties of gel and reference cream

3 結論

通過對凝膠條件單因素實驗和Box-Behnken實驗，結合響應曲面分析，建立起了凝膠參數的二次多項式模型。經過實驗證明通過響應曲面確定的該模型是合理的，能夠較好地預測凝膠的綜合性質。通過模型分析和實驗修正后得到的最佳參數：pH6.5、凝膠溫度47℃、酶與底物濃度比0.8%、氯化鈣2mmol/L、黃原膠0.015%。該條件下所制備的凝膠的綜合素質為0.720，色澤乳黃、質構指標和脂肪比較接近。

[1]翟光超.乳清蛋白研究進展[J].現代農業科技，2008，21：283-285.

[2]李玉美.以乳清蛋白為基質的脂肪替代品的研究[D].無錫：江南大學，2006.

[3]燕紅，張蘭威，朱永軍.牛乳清蛋白的性質及其在食品工業上的應用[J].乳業科學與技術，2002，25（1）：14-17.

[4]Lowe L L，Allen F E，Daubert Christopher R.Rheological properties of fine-stranded whey protein isolate gels[J].Food Hydrocolloids，2003，17：515-522.

[5]Kinsella J E，Whitehead D M.Proteins in whey：Chemical，physical and functional properties[J].Advances in Food Nutritional Research，1989，33：343-438.

[6]李玉美，盧蓉蓉，許時嬰.蛋白質為基質的脂肪替代品研究現狀及其應用[J].中國乳品工業，2005，33（8）：34-37.

[7]Creusot N，Gruppen H.Enzyme induced aggregation and gelation of proteins[J].Biotechnology Advances，2007，25：597-601.

[8]Ju ZY，Otte J，Zakora M，et al.Enzyme-induced gelation of whey proteins：Effect of protein denaturation[J].International Dairy Journal，1997，7（1）：71-78.

[9]李相，劉云，楊江科.基于響應面設計脂肪酶Novo435催化合成甘油二酯的工藝優化[J].生物加工過程，2009，7（5）：13-18.

[10]Charles S B，Carmen M T.Carbohydrate based fat replacers in the modification of the rheological，textural and sensory quality of yoghurt：comparative study of the utilisation of barley beta-glucan，guar gum and inulin[J].International of Food Science and Technology，2008，43：824-833.

[11]劉賀.以桔皮果膠為基質的脂肪替代品的研究[D].無錫：江南大學，2007.

[12]Pan MR.High quality fat replacers from whey proteins[D]. Columbia：University of Missouri-Columbia，2000.

[13]嚴瑞暄.水溶性高分子[M].北京：化學工業出版社，1999.

[14]Otte J，Schumacher E，Ipsen R，et al.Protease-induced gelation of unheated and heated whey proteins：effects of pH，temperature，and concentrations of protein，enzyme and salts[J]. International Dairy Journal，1999，11（9）：801-812.