胰酶提升小麥蛋白酶解產物乳化活性工藝及其功能特性研究

闕 斐，趙 粼，陳錫威

（1.浙江經貿職業技術學院應用工程系，浙江杭州310018；2.杭州康源食品科技有限公司，浙江杭州310000）

小麥蛋白粉是生產小麥淀粉時的副產品，含人體必需的十五種氨基酸，是一種營養豐富的植物蛋白源，但含有較多的疏水性氨基酸和不帶電荷的氨基酸，溶解度較低，不能滿足加工的需要，應用受到限制。目前，由于反應條件溫和、可控性強、能耗低、安全天然等優點，運用酶水解改性小麥蛋白粉已經逐漸成為研究熱點，張影陸[1]、Xiangzhen Kong[2]、張銳昌[3]、齊軍茹等[4]研究了胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶等單酶對小麥蛋白進行改性的效果，而孫麗平[5]、唐勝[6]、林敏剛等[7]研究了堿性蛋白酶和風味酶、米曲霉生長產生的復合酶對小麥蛋白進行改性的效果，改性后的小麥蛋白由于分子結構發生變化，從而使酶解產物的水溶性、乳化性、起泡性、吸水性、粘彈性等功能性質產生較大變化，因此酶解物可作為食品添加劑、營養補充劑、飼料添加劑進行開發，拓寬了小麥蛋白的應用范圍。其中堿性酶、胰酶等，由于可以在堿性條件下較大程度地水解小麥蛋白，產生明顯的改性效果，因此是研究重點，但是目前的報道中，系統的工藝研究與功能特性研究相結合的報道較少。本文以乳化活力為指標，通過正交實驗，較為系統地研究了胰酶水解小麥蛋白的工藝條件，隨后研究了酶解產物的抗氧化活性、分子量分布、氨基酸組成等功能特性，結果可為小麥蛋白深加工開發與工業化提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥蛋白粉 購自徐州澳凱小麥淀粉有限公司；胰酶 購自廣西龐博生物工程有限公司；純花生油 購自山東魯花集團有限公司；DPPH自由基、Ferrozine試劑、AA-S-18氨基酸混標 Sigma公司；其他試劑 均為分析純與色譜純。

HH-4型水浴鍋 國華電器有限公司；T6系列紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；pHS-25B型酸度計 上海大中分析儀器廠；90-1型恒溫磁力攪拌器 上海滬西分析儀器廠；600型高效液相色譜儀 Waters公司，配2487紫外檢測器和Empower工作站帶GPC軟件；TSK系列凝膠色譜柱（G2500PWXL 7.8mm×300mm）；C18柱（4.6mm×250mm，5μm） Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 胰酶活力測定 采用GB/T 23527-2009蛋白酶制劑附錄B福林法。

1.2.2 原始小麥蛋白粉粗蛋白含量測定 采用GB 5009.5-2010食品中蛋白質的測定中的凱氏定氮法進行。

1.2.3 胰酶水解小麥蛋白的工藝流程 適量的蒸餾水→在一定溫度的水浴鍋中保溫→加入一定量的小麥蛋白粉（底物濃度5%）并攪拌→調節溶液的pH于設定的條件→加入適量的胰蛋白酶進行酶解→用1moL/L的NaOH保持溶液的pH不變→攪拌酶解2h→立即在95℃條件下滅酶10min→酶解液。

1.2.4 胰酶水解小麥蛋白工藝優化

1.2.4.1 單因素實驗設計 依次改變酶解pH、溫度、E/S（酶濃度，即酶與底物比），以酶解產物乳化活力指數作為指標進行單因素實驗。

稱取5g小麥蛋白粉于95mL的蒸餾水中，按照固定條件加入胰酶0.05g，水浴溫度為50℃，調節酶解pH分別為pH 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。

稱取5g小麥蛋白粉于95mL的蒸餾水中，按照固定條件加入胰酶0.05g，并調pH至8.5，分別于35、40、45、50、55℃水浴中進行反應。

表1 L9（34）正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

稱取5g小麥蛋白粉于95mL的蒸餾水中，按固定條件調pH至8.5，水浴溫度為50℃，分別加入胰酶0.05、0.15、0.25、0.35、0.45g，使酶濃度分別為1%、3%、5%、 7%、9%進行反應。

1.2.4.2 正交實驗設計 根據單因素實驗結果，確定了三因素三水平的正交實驗，以乳化活力指數為指標，水解度為參考，采取L9（34）正交表進行實驗，因素水平表如表1。

1.2.5 小麥蛋白酶解產物乳化性能測定[8]取45mL蛋白質濃度為0.1%的小麥蛋白酶解溶液（用0.2mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋），加入15mL純正花生油，在10000r/min、室溫下攪拌1min，分別在攪拌0、5、10min后從底部取樣。以0.1%（W/V）SDS（十二烷基硫酸鈉）稀釋100倍，測定500nm處的吸光值A500，以SDS溶液為空白。乳化性能由乳化活力指數EAI表示，計算公式如下：

式中，EAI：乳化活力指數，即每克蛋白質的乳化面積，m2/g；N：稀釋倍數；Ф：油相所占的分數，本實驗中油相占1/4；L：比色池光徑，1cm；C：蛋白質的濃度，g/mL。

1.2.6 小麥蛋白水解度的測定 水解度（DH）測定采用pH-stat法[9]，計算方法如下：

式中，VNaOH為消耗堿液的體積（mL）；NNaOH為消耗堿液的摩爾濃度（mol/L）；а為氨基酸的解離常數；Mp為參加水解的蛋白質總量（g）；Htot為1g原料蛋白質中肽鍵的mmol數，小麥蛋白取9.2。

1.2.7 清除DPPH自由基能力測定 清除DPPH自由基使用的是Que等的方法[10]。取50、100、200μL正交優化工藝所得的小麥蛋白酶解液，用蒸餾水補充為2mL，分別加入2mL 0.1mmol/L的DPPH自由基醇溶液加入。室溫放置30min，于517nm處測定吸光值。用VC作為陽性對照，濃度為1mg/mL。根據下式計算清除率：

式中，A0：空白在517nm處吸光值；A1：樣品在517nm處吸光值。

1.2.8 金屬螯合能力測定 金屬鰲合能力使用Que等的方法進行測定[10]。一些金屬離子在脂質氧化過程中起催化作用，如鐵離子、銅離子等，因此具有對這些金屬鰲合作用的物質可以間接地起到抗氧化的作用。Ferrozine試劑能夠與脂質氧化催化劑Fe2+形成為紫紅色絡合物，當其他有競爭力的絡和劑存在時，紫紅色會變淺。因此通過絡和物顏色的變化，可以評價物質對Fe2+螯合能力，從而評價該物質的抗氧化能力。取200、500、1000μL的正交優化工藝所得的小麥蛋白酶解液，用蒸餾水補充為4.7mL，分別加入0.1mL 2mmol/L的FeCl2和0.2mL 5mmol/L Ferrozine。然后放置于室溫20min，于562nm測定吸光值。用濃度為1mg/mL EDTA和檸檬酸作為陽性對照。螯合能力用下式進行計算：

式中，A0：空白在562nm處吸光值；A1：樣品在562nm處吸光值。

1.2.9 小麥蛋白酶解產物分子量分布 采用GBT 22729-2008海洋魚低聚肽附錄A高效凝膠過濾色譜法測定正交優化工藝所得的小麥蛋白酶解液中蛋白質分子量的分布。

1.2.10 小麥蛋白酶解產物氨基酸組成 正交優化工藝所得的小麥蛋白酶解液中氨基酸組成用呂艷等[11]的方法進行測定。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶活力測定

測得實驗所用的胰酶酶活為1657.43U/g。

2.2 原始小麥蛋白粉的基本數據

測得實驗所用原始小麥蛋白粉中粗蛋白含量為75.23%、EAI值為5.27m2/g。

2.3 單因素實驗結果與分析

2.3.1 pH對小麥蛋白酶解產物乳化活性的影響 pH對小麥蛋白酶解產物乳化活性的影響結果如圖1所示。在pH在7.5～9.5時，小麥蛋白酶解產物的乳化活力指數先增后減。這可能是因為當pH增大時，由于羥基作用使蛋白質中羧基的暴露增多，從而增加了分子間的靜電斥力，使離散雙電層增加，溶液界面膜增厚，提高了乳化性；同時，酶活增加，反應速率加快，同樣提高了其乳化性。但是隨pH繼續增大，酶水解的質子化和去質子化受pH影響較大，從而影響酶對小麥蛋白水解，乳化性下降[12]。因此正交實驗選取了pH7.5～9.0作為研究水平。

圖1 pH對酶解液乳化活力指數的影響Fig.1 Influence of pH on the EAI of the hydrolysate

圖2 溫度對酶解液乳化活力指數的影響Fig.2 Influence of temperature on the EAI of the hydrolysate

2.3.2 溫度對小麥蛋白酶解產物乳化活性的影響 溫度對小麥蛋白酶解產物乳化活性的影響結果如圖2所示。在蛋白酶的最適溫度范圍內，隨著溫度的升高，單位時間內分子間的有效接觸次數增加，有利于蛋白的酶解。小麥蛋白酶解產物在35～40℃時EAI逐漸下降，而溫度在40℃左右時其乳化活力指數最低，而在溫度大于40℃后乳化活力指數呈上升趨勢，并且溫度55℃時乳化活力指數相對較大，并逐漸趨于平緩，由此可見，適當的增加反應溫度，會使小麥蛋白的乳化能力提高，但是溫度過高會使小麥中蛋白質變性，同時小麥淀粉開始糊化[13]，乳化能力反而下降，因此正交實驗選取了45～55℃作為研究水平。

2.3.3 酶濃度對小麥蛋白酶解產物乳化活性的影響酶濃度對小麥蛋白酶解產物乳化活性的影響結果如圖3所示。小麥蛋白酶解產物在酶濃度為1%時乳化活力指數最大，當在酶濃度增大至5%時，乳化活力指數逐漸減小，并趨于平緩。這可能是由于適當的酶濃度使小麥蛋白分子斷裂成較多親水性較強的小肽，分子內部疏水基團暴露，增加了蛋白質的疏水部分，有利于膠束的形成，形成水包油結構，促使乳化活性提高。但當酶濃度太大時，其水解出的更短的小肽，極性更小，形成了油包水結構，乳化活性反而降低[14]。因此正交實驗選取了酶濃度1%～3%作為研究水平。

圖3 酶濃度（E/S）對酶解液乳化活力指數的影響Fig.3 Influence of enzyme concentration（E/S）on the EAI of the hydrolysate

2.4 胰酶水解小麥蛋白工藝優化

表2 正交實驗設計及結果Table 2 Results of orthogonal design

根據單因素實驗結果，選取影響小麥蛋白酶解產物乳化活性因素中有意義的水平做正交實驗，對結果進行極差分析，以確定最佳酶解工藝條件。按照表1的因素水平，設計L9（34）正交實驗，結果見表2。

由表2數據極差分析可知，RC＞RB＞RA，各因素對乳化活性影響程度依次為：酶濃度＞溫度＞pH，酶濃度對小麥蛋白酶解產物乳化活性影響最為顯著，在實驗設計范圍內，優化得到小麥蛋白酶解的最佳工藝條件為：A1B1C1，即pH7.5、溫度45℃、酶濃度E/S為1%，此時乳化活力指數為35.38m2/g。原始小麥蛋白粉的乳化活力指數僅為5.27m2/g，酶解產物的乳化活性有了明顯的提升，也顯著強于本課題組利用酸性蛋白酶對小麥蛋白粉進行改性的最優結果（17.69m2/g）[15]，這可能是由于本實驗所用的胰酶為復合酶，內含胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多種酶類，比使用單一酶類酶解產生更顯著的改性作用[16]。

最優條件下水解度為4.73%，相對來說較低（表2）。很多研究都希望通過酶解改性小麥蛋白，以獲得較高的水解度，從而改善小麥蛋白的溶解性。但是從提升乳化活性角度來說，相對較低的水解度能夠獲得較高的乳化活性。這可能是由于水解度越大，水解出的肽段越小，包裹在油滴表面的保護層越薄，同時小麥蛋白鏈上的末端基團數目增加，電荷增大到一定程度，吸附油滴的能力降低，最終導致乳化性能降低[17]。

2.5 小麥蛋白酶解產物清除DPPH自由基的能力

張玲[18]、崔鳳杰[19]、Wang等[20]報道了小麥蛋白酶解產物具有DPPH自由基清除能力，本實驗（圖4）也證實了最佳工藝條件下（酶濃度為1%、溫度45℃、pH7.5）的小麥蛋白水解液具有一定的DPPH自由基清除能力，當用量為200μL時，清除率為30.2%，但是顯著低于VC。清除率偏低可能由于酶解液中仍含有一定分子量的蛋白，而DPPH溶液由乙醇溶解，在測定過程中，蛋白會變性而影響實驗結果。

圖4 胰酶水解小麥蛋白產物的DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging activity of the hydrolysate

2.6 小麥蛋白酶解產物金屬螯合能力

一些植物性原料，如黃花菜[21]、南瓜[22]提取物具備明顯的金屬螯合能力。本實驗首次發現小麥蛋白胰酶水解產物具有較強的螯合能力（圖5），用量為1000μL時，達到71.3%，顯著強于檸檬酸，但顯著低于EDTA。這可能是由于水解液含有未水解的蛋白質與水解后的多肽，這些物質能和鐵離子發生絡合反應；同時，也可能在酶解反應時，由于淀粉酶的存在，生成了還原糖，還原糖與蛋白質、酶解產生的多肽、氨基酸等發生了美拉德反應，產生了大量的呋喃類、吡嗪類、噻吩類、噻唑類等物質[23]，這些物質能夠絡合鐵離子。

圖5 胰酶水解小麥蛋白產物的金屬螯合能力Fig.5 Metal chelating activity of the hydrolysate

2.7 小麥蛋白酶解產物分子量分布

采用GBT 22729-2008海洋魚低聚肽附錄A中的方法，測定最佳工藝條件下的小麥蛋白酶解液（水溶性部分）的分子量分布，分離圖譜如圖6所示，分子量分布表如表3所示。實驗結果表明，胰酶水解小麥蛋白產物的分子量主要分布在200～1000u，占65.99%，其次為1000～2000u，占12.34%，分子量較小，大部分是親水性較強的肽類，能夠適當增加蛋白質的水溶性，此時酶解產物中親水基團和親油基團形成了較為合適的比例，因而改善了小麥蛋白的乳化性能。同時分子量較小的肽容易穿過細胞膜從而更好地發揮生物活性，分子量小于3000u的肽類具有明顯的自由基清除能力[18]，因此這些肽類可能是酶解產物具備有乳化活性、抗氧化活性等功能特性的重要貢獻者。

圖6 胰酶水解小麥蛋白產物的分子量測定圖譜Fig.6 Chromatogram of molecular weight in the hydrolysate

表3 胰酶水解小麥蛋白產物的分子量分布Table 3 Distribution of molecular weight in the hydrolysate

2.8 小麥蛋白酶解產物氨基酸組成

取小麥蛋白酶解產物樣品，按設定條件進行衍生和HPLC分離，小麥蛋白酶解產物中各種氨基酸的含量如表4。酶解產物經完全水解后，獲得了15種氨基酸，總含量為3.76%（w/v），與張玲[17]的報道相似，其中谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量較多，谷氨酸含量達30.48%，其在蛋白質中以谷胺酰胺形式存在，是一種條件必需基酸；同時，人體必需的氨基酸含量達7種。

表4 胰酶水解小麥蛋白產物的氨基酸組成Table 4 Content of amino acids in the hydrolysate

3 結論

本文以乳化活力為指標，系統地研究了胰酶水解小麥蛋白的工藝條件，酶解產物的抗氧化活性、分子量分布、氨基酸組成等功能特性。結果表明，最佳酶解條件為：酶濃度E/S為1%、溫度45℃、pH7.5，乳化活力指數達到35.38m2/g，此時水解度為4.73%，顯著提升了小麥蛋白的乳化活性。根據極差分析，三因素對乳化活力的影響大小為：酶濃度＞溫度＞pH。最佳工藝條件下的小麥蛋白酶解液具有一定的DPPH自由基清除能力，但顯著低于VC；首次發現了酶解液具有較強的金屬螯合能力，顯著強于課題組在類似條件下利用酸性酶、堿性酶、木瓜蛋白酶對小麥蛋白進行改性的產物的金屬螯合能力。酶解小麥蛋白產物中多肽分子量主要分布在1000～200u，占65.99%；酶解產物中共檢測出了15種氨基酸，谷氨酸含量最高，達30.48%；肽類可能是酶解產物具備有乳化活性、抗氧化活性等功能特性的重要貢獻者。

綜上，胰酶水解小麥蛋白產物具有較大的食品添加劑、保健產品開發價值。但是值得注意的是，酶解產物中含有較多的苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸和酪氨酸四種具有較強苦味的氨基酸（15.25%），這些氨基酸大部分并不能被蛋白酶水解下來，而是存在于肽鏈中，形成分子量為500～1000u的多肽，這些多肽對酶解產物的風味會造成嚴重的影響，這也是酶解產物有苦味、麥麩味的原因，因此必須進一步研究酶解產物脫除異味的方法，以期為更好地應用開發。

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