星點設計-效應面法優化姬松茸多糖分散片的處方

張彥青, 喬龍東，張婷, 葉媛媛, 張明春，解軍波*

（1天津商業大學 生物技術與食品科學學院，天津 300134；2天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

姬松茸（Agaricus blazei Murill），又叫巴西蘑菇，是一種珍貴的藥食兼用真菌[1]。現代研究表明，姬松茸具有抗氧化[2]、抗腫瘤、免疫調節[3]、抗病毒[4]等多種生物活性，因此逐漸成為當前國內外食用菌研究開發的熱點品種。姬松茸的化學成分種類多樣，包括多糖、蛋白、核酸、甾醇、三萜以及脂肪酸[5-6]等。其中，多糖被認為是姬松茸主要的活性物質，具有顯著的抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、腎臟保護[9]、心肌保護[10]、免疫調節[11]、降血糖[12]等作用，在新型保健食品方面有較為廣闊的開發前景,目前已經廣泛應用于獸藥等產品中[13-14]。

分散片是指在水中能迅速崩解并均勻分散的片劑[15]，與普通片劑、膠囊劑等固體制劑相比，具有制備簡單、服用方便、崩解迅速及吸收快等特點。星點設計-效應面法具有實驗次數少，精密度比傳統的正交設計與均勻設計法更高、且預測值接近真實值的特點，尤其是對非線性模型的實驗，分析所得結果的準確度更高[16-17]。

為了更好的開發利用姬松茸多糖資源，本研究采用濕粉制粒壓片法制備多糖分散片，并采用星點設計-響應曲面法優化該分散片的處方，對姬松茸的綜合利用和新產品開發具有一定的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姬松茸多糖 自制；β-環狀糊精 郁南縣永光環狀糊精有限公司; 交聯羧甲基纖維素鈉天津市雅博生物工程技術有限公司；微晶纖維素 JRS PHARMA; 滑石粉、羥丙纖維素 北京鳳禮精求商貿有限責任公司。

BP211D電子分析天平 德國Sartoriμs公司；DP30A型單沖式壓片機 北京國藥龍立科技有限公司；ZBS-6G智能崩解實驗儀 天津大學無線電廠； YD-I片劑硬度測試儀天津市鑫洲科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 姬松茸多糖的制備 取姬松茸干品，粉碎，過60目篩，得姬松茸粉。將上述姬松茸粉進行微波提取[1]。將所得姬松茸水提液，冷卻至室溫，離心10分鐘（4500r/分鐘）。取上清液，加入5倍體積量乙醇，醇沉12小時，分取沉淀，并采用三氯醋酸法進行脫蛋白處理，即得。

1.2.2 分散片的制備 按濕法制粒壓片法，將原輔料分別過100目篩，按試驗設計中的處方比例稱取姬松茸多糖、羥丙纖維素和微晶纖維素等，混合均勻后加入潤濕劑(95%乙醇溶液)制成軟材，過18目篩制濕顆粒，60℃干燥箱干燥1.5h，18目篩整粒，加入處方量的交聯羧甲基纖維素鈉、滑石粉，混合均勻后壓片，片重為200mg。

1.2.3 崩解時限檢查 按照2010年版《中華人民共和國藥典》二部附錄XA[18]崩解時限測定方法，隨機取6片分散片，用崩解儀測定崩解時間，在3min內崩解視為合格。

1.2.4 分散均勻性檢查 按照2010年版《中華人民共和國藥典》二部附錄IA[18]分散片項下要求，隨機取6片分散片，振搖3min，應全部崩解并通過二號篩為合格。

1.2.5 硬度測定 按最佳工藝處方制備3批姬松茸多糖分散片，每批隨機取6片，采用片劑硬度測試儀測定其硬度。

1.2.6 考察因素的確定 采用單因素考察法對處方中各影響因素的作用進行了初步考察，在單因素實驗的基礎上，以對姬松茸多糖分散片質量影響較大的姬松茸多糖用量（X1），交聯羧甲基纖維素鈉用量（X2）和羥丙纖維素的用量（X3）為自變量，以崩解時間（Y）采用星點設計設計3因素5水平實驗，制備分散片（方法同1.2.1），并保證每片重200mg（±5%）。

1.2.7 效應面試驗設計 本試驗應用旋轉CCD法(central composite design)進行設計，采用公式α=(2k)1/4計算α值（k：待考察因素的個數）。本試驗中k為3，計算可得α=1.682；對每個因素確定5個水平（0、±1、±α），各因素及水平見表1。

表1 考察因素各水平的代碼值及實際操作物理量Table 1 The code value and actual amount of investigated factors levels

1.2.8 最優實驗條件的選擇

將參數優化擬合后代入方程，得到Y值對實驗因素的響應曲面關系。通過直觀作圖分析法或者對方程用求偏導等方法，可得到使Y值最低的因素值。本試驗采用Microsoft Excel中規劃求解功能求得曲面中最低點[19]。

2 結果與分析

2.1 星點設計實驗結果

星點設計實驗安排及結果見表2，以崩解時限作為評判姬松茸多糖分散片的考察指標，篩選最佳處方，同時考察其分散均勻性。

表2 星點設計實驗安排及結果Table 2 The design and result of central composite design-response surface methodology

*：崩解時間大于300的以300計。

2.2 處方優化與預測

當考察多因素時，由于各因素之間存在相互影響關系，所對應的效應面往往彎曲度較大，線性模型相關系數較低，模型預測性較差，而采用二次以上的多元非線性方程式則能提高優化效果。本試驗以X1、X2、X3為自變量,Y為因變量，進行多元線性回歸和二次多項式回歸，以擬合優度(R2)和置信度(P)作為模型的判定指標，如下所示：

多元線性模型：Y=B0+B1X1+B2X2+B3X3

二次多項式模型：Y=B0+B1X1+B2X2+B3X3+B4X1X2+B5X2X3+B6X1X3+B7X12+B8X22+ B9X32，其中B0為常數項。

數據經多元線性回歸處理后，得擬合方程為：Y=105.95 + 77.59X1-26.41X2+26.61X3(R2=0.7734, p=0.0018)，由R2值（0.7734）可知，Y值與各因素之間線性相關性較差。因此，進一步采用二次多項式非線性回歸擬合，所得方程如下：Y = 72.22 +77.59X1- 26.41X2+23.61X3-9.50X1X2+ 32.25X1X3-14.25X2X3+26.13X12+37.80X22- 14.53X32(R2=0.9309, p=0.0024) 。結果（R2=0.9309）表明，擬合效果明顯優于多元線性回歸，因此可以作為本試驗分析及預測的模型。

對各項系數進行方差分析，結果見表3。p值代表各項系數的可信程度，由顯著性檢驗可知，模型中一次項X1(p<0.001)極顯著，二次項X22(p<0.05)顯著，其它因素不顯著。表明多糖用量對姬松茸多糖分散片的崩解時間有顯著影響。

表3 二項式回歸模型系數顯著性檢驗表Table 3 Regression coefficients and analysis of of the response surface model

根據二項式擬合方程，采用軟件描繪Y值對兩因素的三維效應面圖 (其他1個自變量設為中心點值) ，見圖1-3。

圖1 Y值對X1和X2的三維效應面圖Fig.1 Three-dimensional response surface of Y in relation to X1 and X2

由圖1可知，當固定多糖用量不變時，隨著交聯羧甲基纖維素鈉用量的增大，分散片的崩解時間呈先減少后增加的趨勢；而固定交聯羧甲基纖維素鈉用量不變時，隨著多糖用量的增大，崩解時間呈現增加的趨勢。

圖2 Y值對X1和X3的三維效應面圖Fig.2 Three-dimensional response surface of Y in relation to X1 and X3

由圖2可知，當固定羥丙纖維素用量不變時，隨著多糖用量的增大，分散片的崩解時間呈增加的趨勢；只有當多糖用量較大時（50%），羥丙纖維素的用量對崩解時間的影響較明顯。

圖3 Y值對X2和X3的三維效應面圖Fig.3 Three-dimensional response surface of Y in relation to X2 and X3

由圖3可知，當固定羥丙纖維素用量不變時，隨著交聯羧甲基纖維素鈉的增大，分散片的崩解時間呈先減少后增加的趨勢；羥丙纖維素的用量對崩解時間的影響較小。

在三維效應面圖中，選取較理想的區域，考察其Y值較小的自變量范圍，結合實際生產工藝，優化最佳處方條件為多糖用量27.54%，交聯羧甲基纖維素鈉7.79%，羥丙纖維素4.17%，微晶纖維素59.5%，滑石粉1%。

按照優化處方比例及1.2.2項下姬松茸多糖分散片的制備方法，制備姬松茸多糖分散片3批，檢測其片劑的崩解時間，結果見表4。

表4 最優化處方的預測值與實測值的比較（崩解時間）Table 4 Comparison of measured value and predicted value of optimal formulation（disintegrating time）

1 22.62 23 1.68 3.07 2 22.62 23.2 2.56 2.34 3 22.62 23.4 3.45 1.93

從表4可知，各項指標誤差均小于5%，說明本試驗所建立的模型方程能非常好地描述效應面與各因素之間的關系。

使用片劑硬度測定儀對3批姬松茸多糖分散片的硬度進行測定，結果見表5。

表5 硬度測定結果Table 5 The results of hardness test

由上表可知，3批姬松茸多糖分散片的硬度均在3.0～5.0kg范圍內，RSD均小于2%，說明該處方工藝滿足分散片的制備要求。

3 結論

本研究通過星點設計法，對處方進行優化，進行二元多項式擬合，并利用響應面模型對崩解時間進行方差分析，繪制了崩解時間與影響顯著的自變量的三維效應面，得出預測條件和預測結果。優化處方是姬松茸多糖27.54%，交聯羧甲基纖維素鈉7.79%，羥丙纖維素4.17%，微晶纖維素59.5%，滑石粉1%。按此處方制備了3批分散片，其實測值與預測值的偏差較小，說明該方法預測性能較好，可以準確地優化姬松茸多糖分散片的處方。

[1] 梁婷，趙亞男，劉愛麗，等. 微波法提取姬松茸多糖的工藝研究[J]. 食品工業科技，2013，34（4）：236–238.

[2] 陳體強，吳巖斌，王敏惠，等. 有機姬松茸浸膏粉化學成分及體外抗氧化活性[J].食品研究與開發，2013，34（5）：1–3.

[3] Ishii P L，Prado C K，Mauro M de O，et al. Evaluation of Agaricus blazei in vivo for antigenotoxic, anticarcinogenic, phagocytic and immunomodulatory activities[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology，2011，59（3）：412–422.

[4] 樊廷俊，錢冠蘭，杜玉堂，等. 姬松茸提取物組分體外抗病毒感染活性的研究[J].中國海洋大學學報：自然科學版，2008，38（5）：775-780.

[5] 林戎斌， 林陳強，張慧，等.姬松茸食藥用價值研究進展[J].食用菌學報，2012，19（2）：117–122.

[6] 楊鑑鋒，吳小蘋. RP-HPLC-MS離線聯用分析姬松茸中齊墩果酸和熊果酸的含量[J].海峽藥學，2008， 20（7）：50–52.

[7] Yue L，Cui H，Li C，et al. A polysaccharide from Agaricus blazei attenuates tumor cell adhesion via inhibiting E-selectin expression [J]. Carbohydrate Polymers， 2012，88（4）：1326–1333.

[8] 王偉娟，馮翠萍，常明昌，等. 姬松茸多糖對鉛中毒雄性大鼠的抗氧化作用[J]. 中國食品學報，2013，13（6）：15–19.

[9] 何芳.姬松茸多糖對運動力竭小鼠腎臟的保護作用研究[J]. 海軍醫學雜志，2013， 34（5）：155–157.

[10] 楊旭東，張杰，王春濤.姬松茸多糖對體外高糖培養乳鼠心肌細胞保護作用[J].食用菌，2011，（6）：65–66.

[11] 賈薇，樊華.姬松茸多糖組分對小鼠巨噬細胞作用研究[J].食品科學，2011，32（11）： 277–280.

[12] 楊旭東，張杰，申梅淑. 姬松茸多糖對2型糖尿病大鼠代謝及抵抗素基因表達的影響[J]. 中國食物與營養，2010，（1）：74–76.

[13] 段縣平, 趙鎖花, 馬吉飛, 等. 口服姬松茸多糖對雞疫苗免疫力及紅細胞免疫功能影響的研究[J]. 中國畜牧獸醫，2006, 33（6）：17-19

[14] 葛紅霞，漢麗梅. 姬松茸多糖對AA肉雞生產性能的影響[J]. 當代畜牧，2012（4）：35-36

[15] 李志紅，賈曉麗，石磊.中藥分散片的處方與工藝研究進展[J].中國藥業，2007，16 （17）：757–761.

[16] K? rbhati BK，Aktas N， Tanyolac A. Optimization of electrochemical treatment of industrial paint wastewater with response surface methodology [J]. Journal of Hazardous Materials，2007，148（1）：83–90.

[17] Karacan F，Ozden U，Karacan S. Optimization of manufacturing conditions for activated carbon from Turkish lignite by chemical activation using response surface methodology [J]. Applied Thermal Engineering，2007，27(7)：1212–1218.

[18] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版)（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄IA，XA.

[19] 張婷，張華，沈宇燕，等.星點設計-效應面法優化酸棗仁黃酮滴丸處方[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（14）：26-31.