p53在骨關節炎軟骨組織中的表達及與關節軟骨細胞自噬的關系研究*

張志宇許珂王靜許鵬

p53在骨關節炎軟骨組織中的表達及與關節軟骨細胞自噬的關系研究*

張志宇①許珂②王靜①許鵬②

目的：研究p53在骨關節炎軟骨組織中的表達及與關節軟骨細胞自噬的關系。方法：對20例骨關節炎患者（OA組）及10例正常膝關節軟骨組織（對照組），用實時定量PCR（real-time PCR）、免疫組化等方法檢測p53及Beclin1在膝關節軟骨中的表達與分布，并對兩者進行相關性分析。結果：p53在OA組的表達明顯高于正常對照組（P＜0.05），OA組關節軟骨組織中Beclin1的表達量明顯低于正常對照組（P＜0.01），p53 與Beclin1在軟骨組織中表達呈負性相關（r=-0.629，P＜0.05）。結論：骨關節炎中p53的高表達能夠抑制軟骨細胞自噬，從而減弱軟骨細胞對凋亡抵抗能力，促進軟骨細胞凋亡。

骨關節炎； 自噬； p53； Beclin1

骨性關節炎（Osteoarthritis，OA）是一種常見的慢性退行性關節病，其主要病理改變是關節軟骨細胞的減少和軟骨基質的降解，是致殘致畸的主要原因之一[1]。OA軟骨細胞的減少主要由于軟骨細胞過度凋亡引起，引起OA軟骨細胞過度凋亡的原因一直是近年來的研究熱點。隨著自噬現象的發現及其與凋亡關系研究的不斷深入，有學者發現自噬在OA軟骨細胞中減弱，從而促進凋亡，但OA軟骨細胞自噬減弱的原因并不清楚[2]。最新研究認為，抑癌基因p53是調控細胞凋亡和自噬的重要因子[3]。因此，本研究通過檢測p53及自噬調節因子Beclin1在OA軟骨細胞中的表達，探索OA軟骨細胞自噬減弱的原因，為OA的基礎及臨床研究提供新的方向及思路，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2012年11月-2013年4月在西安交通大學醫學院附屬紅會醫院住院預接受膝關節置換手術治療患者中，根據根據美國風濕病學會（ACR）2008年修訂的OA診斷標準，通過病史、臨床檢查和X線平片等確診OA患者共20例作為OA組。其中男6例，女14例，平均年齡（71.3±8.9）歲。同時收集無關節疾病史及肉眼病變的因外傷截肢、交叉韌帶斷裂、半月板損傷等行手術治療的膝關節患者共10例作為對照組，其中男8例，女2例，平均年齡（42.4±6.7）歲，經病理學診斷關節病變，作為正常對照組。受試者均知情同意參加本實驗并經過醫學倫理委員會批準。兩組受試者一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及方法

1.2.1 主要試劑 p53及Beclin1引物由南京金斯瑞公司合成，引物信息見表1；逆轉錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司；SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ購自日本Takara公司；p53及Beclin1多克隆抗體購自中國臺灣Abnova公司，即用SP免疫組化兩步法檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

表1 引物信息

1.2.2 方法 30例新鮮標分為兩部分：一部分立即放入4%多聚甲醛中固定，10%EDTA脫鈣6、7周，常規脫水，石蠟包埋，以4～5 μm厚度連續切片。行常規HE染色外，按試劑盒內說明分別行p53及Beclin1免疫組織化學染色，用已知的陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照，經染色后，陽性信號呈黃褐色。每張切片隨機選取5個高倍視野（×200），計算陽性染色細胞所占細胞總數的百分比；另一部分放入1‰DEPC水處理過的凍存管中浸液氮24 h后，轉移到-80 ℃凍存，Trizol法提取軟骨組織總RNA，經微量核酸/蛋白定量儀鑒定并定量后，根據Fermentas公司提供說明書進行逆轉錄，對逆轉錄產物進行擴增，反應結束后，立即進行熔解曲線分析，用于判定PCR反應的特異性，是否有非特異性擴增產物；瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物條帶是否單一；內參照為β-actin，基因表達量采用ΔΔCt法進行計算。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，對數據進行方差齊性及正態性檢驗后，根據情況，兩組間均數的比較用Mann-Whitney U檢驗或t檢驗；OA軟骨細胞中p53與Beclin1基因水平表達量用Pearson或Spearman檢驗進行相關性分析以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE及免疫組織化學染色結果 20例OA組與10例對照組的膝關節軟骨組織經HE染色后比較軟骨組織的厚度、形態及軟骨細胞的數量可見：OA軟骨變薄、缺損，軟骨表面毛糙，軟骨細胞數量減少，呈簇狀生長（見圖1A、B）。OA關節軟骨中p53陽性細胞主要分布于表層和中層，細胞質及細胞核均有表達；對照組關節軟骨陽性細胞分布部位與OA相似，但數量少，陽性細胞數低，兩組間差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1C、D、圖2。OA關節軟骨四層結構中均可見到Beclin1陽性細胞分布，主要表達于細胞質；對照組關節軟骨陽性細胞分布部位與OA相似，但數量較多，陽性細胞數高，兩組間差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1E、F、圖2。

圖1 p53與Beclin1蛋白在關節軟骨細胞中的免疫組織化學染色

圖2 p53與Beclin1蛋白在關節軟骨細胞中的表達量分析

2.2 real time PCR結果 用realtime qPCR的方法檢測p53及Beclin1的表達，β-actin作為內參照。結果顯示p53在OA患者的關節軟骨組織中表達顯著高于對照組（P＜0.01），而Beclin1在OA患者的關節軟骨組織中表達顯著低于對照組（P＜0.01），見圖3。

圖3 p53與Beclin1基因在關節軟骨細胞中的表達量分析

2.3 相關性分析結果 OA患者20例關節軟骨組織中p53及Beclin1基因的表達進行相關性分析，得出r=-0.629（P＜0.05），故認為OA組織中p53及Beclin1基因的表達之間具有相關性，且呈負相關，見圖4。

圖4 p53與Beclin1基因表達的相關性分析

3 討論

OA軟骨細胞的減少主要由于軟骨細胞過度凋亡引起[4]。Gobbi等[5]發現在OA膝關節軟骨的表層和中層有過度的細胞凋亡。應用TUNEL法和熒光標記的鈣依賴性的磷脂結合蛋白V法檢測正常組和OA組的髖關節軟骨發現，在OA的關節軟骨中有18%～21%的軟骨細胞出現凋亡的特征，而只有2%～5%有凋亡特征的軟骨細胞出現在正常組關節軟骨中[6]。

OA軟骨細胞過度凋亡與凋亡基因過度表達有關[7]。p53是重要的抑癌基因，在轉錄水平上調促凋亡基因如Bax、PUMA和NOXA，下調凋亡抑制基因如Bcl-2的表達[8]。細胞質中的p53使 Bax誘導的MOMP增加[9]。NO表達增加、細胞外基質降解可以增加軟骨細胞中p53的表達，進而誘導軟骨細胞凋亡[10]。本研究也證實OA中p53無論在基因水平及蛋白表達水平均高于正常對照組，且主要分布在表層和中層，細胞質與細胞核均有表達。

研究發現，自噬參與了OA軟骨細胞凋亡的調節。自噬通過降解蛋白及殘余細胞器為細胞節約并提供能量，清除某些有害的蛋白來防止或減少由這些聚集蛋白所引起的細胞毒性，中和細胞的應激反應[11]。Beclin1是重要的自噬調節基因，它與Vps34形成的復合物可使磷脂酰肌醇磷酸化形成PI3P。PI3P招募并引導自噬相關蛋白定位，進而介導自噬體的成核[12]。在OA大鼠模型的研究中發現自噬標記物LC3Ⅱ與Caspase3表達分布相反[13]。在OA患者的軟骨組織中研究發現，隨著疾病嚴重程度的增加Beclin1介導的自吞噬途徑逐漸減弱，且與軟骨細胞凋亡呈負相關[2]。自噬是保證關節軟骨細胞獲取ATP、中和應激的重要手段，因此自噬被抑制使得軟骨細胞抵抗凋亡刺激的能力下降。

近年研究發現，p53不僅可以促進凋亡，也能調節自噬。腫瘤自噬的研究中發現，細胞質中的p53可抑制Beclin1介導的自噬，因此當物質和能量缺乏時，雖然p53表達降低，但細胞為維持ATP水平自噬不僅沒有減弱反而增強[3]。本研究在OA軟骨細胞中也證實p53與Beclin1基因表達呈負相關，說明關節軟骨中p53可能抑制了Beclin1介導的自噬反應，進而使得OA軟骨細胞更易發生凋亡。

綜上所述，由于OA中由于NO表達增加、細胞外基質降解等損傷因子增加，導致OA軟骨細胞p53表達增加，除了直接誘導凋亡外，還可使Beclin1介導的自噬水平降低，從而削弱自噬對軟骨細胞保護作用（如提供ATP、中和應激反應等），進一步加劇OA軟骨細胞的凋亡。中止或者減弱這一過程，可能對減少OA細胞凋亡，甚至延緩OA軟骨退變的進展，具有一定積極的意義。但OA軟骨細胞中p53抑制Beclin1的具體機制還須進一步在細胞水平及分子水平進行研究。

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The Expression of p53 in Osteoarthritis Cartilage Tissue and the Research of Relationship with the Articular Cartilage Cell Autophagy

/ZHANG Zhi-yu，XU Ke，WANG Jing，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（15）：001-004

Objective：To investigate the expression of p53 in osteoarthritis and the correlation with autophagy of articular chondrocytes.Method：Real time PCR and Immunohistochemical methods were used to determine the expression of p53 and Beclin1 of articular chondroeytes of osteoarthritis from 20 patients with the osteoarthritis group and 10 patients with the normal control group and the correlation between them was analyzed.Result：Expression of p53 in the OA group was significantly higher than the normal control group（P＜0.05）.Expression of Beclin1 in the OA group was significantly lower than the normal control group（P＜0.01）.It had negative correlation between the p53 and Beclin1 in OA articular chondrocytes（r=-0.629，P＜0.05）.Conclusion：The high expression of p53 in osteoarthritis can inhibit autophagy cartilage cells，weaken the cartilage cell resistance to apoptosis，and promote the apoptosis of cartilage cells.

Osteoarthritis； Autophagy； p53； Beclin1

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.15.001

2014-03-17） （本文編輯：歐麗）

國家自然科學基金資助項目（81171742、81271948）

①西安交通大學醫學院 陜西 西安 710061

②西安交通大學醫學院第三附屬醫院

許鵬

First-author’s address：Xi’an Jiaotong University Health Science Center，Xi’an 710061，China