重組抗人表皮生長因子受體（EGFR）嵌合單克隆抗體CH225非還原電泳純度分析

付換成盧秋麗劉浩張文秋趙云

重組抗人表皮生長因子受體（EGFR）嵌合單克隆抗體CH225非還原電泳純度分析

付換成①盧秋麗①劉浩②張文秋③趙云①

目的：分析CH225在非還原電泳時(shí)抗體條帶主條帶以外在高分子量和低分子量產(chǎn)生雜條帶的原因。方法：在不同的供試品緩沖液和不同電泳條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳比較。結(jié)果：上樣前100 ℃煮樣1 min與加碘乙酰胺結(jié)果相同。結(jié)論：高分子量和低分子量雜條帶可以用電泳上樣前100 ℃煮樣1 min消除即可。

非還原SDS-PAGE； 重組單抗； EGFR； 重組抗人表皮生長因子受體

藥品生產(chǎn)過程中，重組蛋白類藥物的質(zhì)量檢測和控制十分重要，SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）是蛋白類藥物的純度分析的常用手段[1-2]。CH225（重組抗人表皮生長因子受體（EGFR）嵌合單克隆抗體）是四川恒星生物制藥有限公司采用基因工程技術(shù)，利用NS/0細(xì)胞表達(dá)的人源化抗體，屬于IgG1亞型，已用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、頭頸癌等多種癌癥的治療，并且現(xiàn)有研究表明可能適用于鼻咽癌、肺癌等其他癌癥的治療[3-4]。在CH225的臨床前研發(fā)，質(zhì)量檢測的過程中發(fā)現(xiàn)，除抗體主條帶以外，還存在一些分子量大小不同的雜條帶，特別在非還原性實(shí)驗(yàn)中，情況尤為明顯。本文采用不同溫度和不同試劑的條件下對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，比較最佳的SDS-PAGE結(jié)果，為CH225批量生產(chǎn)的質(zhì)量檢測和控制提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品 參比品（批號(hào)C201105002）：四川恒星生物制藥有限公司于2011年5月第2批生產(chǎn)的CH225注射液；對(duì)照品（批號(hào)C201107006）：四川恒星生物制藥有限公司于2011年7月第6批生產(chǎn)的CH225注射液；愛比妥（Erbitux）：通用名西妥昔單抗（cetuximab），默克公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑和儀器 SDS-PAGE電泳裝置和掃描儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 緩沖液的配制 還原型SDS-PAGE供試品緩沖液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚藍(lán)，4% SDS，200 mmol/L DTT；非還原型SDS-PAGE供試品緩沖液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚藍(lán)，4% SDS；天然供試品緩沖液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚藍(lán)；加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE供試品緩沖液（2×）：向上述非還原SDS-PAGE供試品緩沖液中加入新鮮配制的1 mol/L碘乙酰胺母液，至終濃度為200 mmol/L。

1.4 實(shí)驗(yàn)過程

1.4.1 70 ℃與100 ℃水浴非還原SDS-PAGE分析C201105002（參比品）、稀釋至2 mg/mL與2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，70 ℃分別水浴1、3、5 min后，立即轉(zhuǎn)入冰浴。另取相同樣品加入與2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，100 ℃分別水浴1、3、5 min，立即轉(zhuǎn)入冰浴。再取相同樣品加入2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，不經(jīng)水浴。分離膠濃度8.0%，10 μL/孔上樣，100 V電壓開始電泳，待指示劑前沿進(jìn)入分離膠后，電壓改為150 V。電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色[5]。

1.4.2 普通非還原SDS-PAGE與天然SDS-PAGE分析 C201105002（參比品）和Erbitux樣品均稀釋至2 mg/mL與2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，分別70 ℃水浴3 min、100 ℃水浴1 min后，立即轉(zhuǎn)入冰浴。分離膠濃度8.0%，10 μL/孔上樣，100 V開始電泳，待指示劑前沿進(jìn)入分離膠后，電壓改為150 V。另取相同樣品加入天然供試品緩沖液后不進(jìn)行加熱變性處理，直接進(jìn)行SDS-PAGE電泳。再取相同樣品加入2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，不經(jīng)水浴進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色[5]。

1.4.3 添加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE分析C201105002（參比品）、C201107006和Erbitux樣品均稀釋至2 mg/mL，分別加入2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液或加碘乙酰胺的2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液，混勻后，70 ℃水浴3 min。分離膠濃度8.0%，上樣量10 μL，采用室溫條件下150 V恒壓電泳。電泳結(jié)束后，SDS-PAGE凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色[1]。

2 結(jié)果

2.1 70 ℃與100 ℃不同時(shí)間水浴非還原SDS-PAGE分析 70 ℃分別處理1、2、3 min的樣品電泳結(jié)果的相對(duì)分子量小的次帶依次減少，70 ℃ 3 min相對(duì)分子量小的次帶已基本不可見；100 ℃ 1、2、3 min時(shí)相對(duì)分子量小的次帶有增加趨勢，100 ℃ 1 min時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量小的次帶已基本消失；未經(jīng)水浴的條帶出現(xiàn)多個(gè)雜的相對(duì)分子低的次帶。表明對(duì)樣品進(jìn)行70 ℃ 3min或者100 ℃ 1 min的水浴處理對(duì)減少相對(duì)分子小的次帶有較好的效果，見圖1。

圖1 70 ℃與100 ℃不同時(shí)間水浴非還原SDS-PAGE

2.2 普通非還原SDS-PAGE與天然SDS-PAGE分析 未經(jīng)水浴的樣品中相對(duì)分子量大和相對(duì)分子量小的雜條帶比較明顯；對(duì)樣品進(jìn)行過預(yù)處理的電泳結(jié)果條帶單一；而對(duì)樣品未經(jīng)預(yù)處理的天然SDS-PAGE電泳結(jié)果出現(xiàn)彌散狀條帶，見圖2。

圖2 普通非還原SDS-PAGE與天然SDS-PAGE

2.3 添加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE分析 愛比妥、C201107006、參比品在添加碘乙酰胺的情況下都比其沒有添加碘乙酰胺的相對(duì)分子量小的次帶要少得多；添加碘乙酰胺的樣品和未添加碘乙酰胺但經(jīng)過100 ℃ 1 min水浴的樣品的相對(duì)分子量小的次帶都明顯減少；在70 ℃ 3min煮樣后再添加碘乙酰胺對(duì)減少相對(duì)分子量小的次帶基本沒有效果，見圖3。

圖3 添加碘乙酰胺與未添加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE

3 討論

由以上實(shí)驗(yàn)，可推測，電泳中低分子量條帶可能由這些原因?qū)е拢涸诨虮磉_(dá)過程中，抗體分子內(nèi)存在自由巰基，這些自由疏基因?yàn)闊o法形成完整的二硫鍵，輕鏈和重鏈之間只能由非共價(jià)鍵的作用力連接[6-7]；在電泳時(shí)樣品的加熱變性處理或未經(jīng)處理的過程中（如圖2），輕鏈和重鏈之間的非共價(jià)鍵斷裂，因此而導(dǎo)致產(chǎn)生了一些游離的抗體分子亞基，從而出現(xiàn)了低相對(duì)分子質(zhì)量條帶[8]；另外，在電泳時(shí)樣品的加熱變性處理的條件下，抗體分子的自由巰基還可能會(huì)引發(fā)二硫鍵重排，導(dǎo)致部分鏈間二硫鍵斷裂，增加低相對(duì)分子質(zhì)量條帶出現(xiàn)的幾率[9-10]。

高分子量聚體帶產(chǎn)生的可能原因是，在加熱變性處理的過程中，抗體分子間的自由巰基通過縮合形成分子間二硫鍵，從而將單體的抗體分子連接成分子聚體，出現(xiàn)聚體帶[7-9]。碘乙酰胺可以保證蛋白質(zhì)樣品完全變性并保持還原狀態(tài)，可以對(duì)蛋白質(zhì)分子中的自由巰基進(jìn)行封閉，以阻止二硫鍵重排的反應(yīng)以及自由巰基重新形成二硫鍵，從而抑制電泳次帶的產(chǎn)生[8，11-12]。封閉自由巰基后的非還原SDS-PAGE結(jié)果顯示，如圖3中所示，高相對(duì)分子量的聚體帶基本消失，低相對(duì)分子量帶顯著減少，證明非還原SDS-PAGE結(jié)果中出現(xiàn)的次帶是在電泳樣品變性處理過程中因有自由巰基的存在而產(chǎn)生的。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鑒于100 ℃煮樣1 min情況下，加不加碘乙酰胺對(duì)次帶形成影響不大，因此以后CH225項(xiàng)目質(zhì)量檢測的SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)采用100 ℃煮樣1 min，不加碘乙酰胺的預(yù)處理方案。

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Analysis of the Recombinant Monoclonal EGFR Antibody （CH225） on non-reducing SDS-PAGE

/FU Huan-cheng，LU Qiu-li，LIU Hao，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（15）：028-030

Objective：To analyze the non-Reduced SDS-PAGE purity of monoclonal antibody CH225 and the reason of the appearance of bands with a lower or a higher molecular weight.Method：The EGFR samples were treated with various loading buffers and various conditions for SDS-PAGE.Result：The result of incubation of 100℃ for 1 min appeared the same to the result with iodoacetamide added.Conclusion：The appearance of the bands with a lower or a higher molecular weight may be eliminated by incubation of 100 ℃ for 1 min for SDS-PAGE.

Non-Reduced SDS-PAGE； Recombinant monoclonal antibody； EGFR； Recombinant EGFR antibody

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.15.010

2014-03-03）（本文編輯：歐麗）

①四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川 成都 610064

②四川恒星生物制藥有限公司

③四川大學(xué)華西藥學(xué)院

趙云

First-author’s address：College of Life Science in Sichuan University，Chengdu 610064，China