嗜冷酶的特性及其在食品工業上的應用

王繼蓮，魏云林，李明源，*

(1.喀什師范學院生物與地理科學系葉爾羌綠洲生態與生物資源研究實驗室，新疆喀什844000; 2.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明650500)

在地球這個大的生態系統中，超過80%的地方溫度低于5℃，如占地球表面14%的南北兩極地區、高山、深海及冰川凍土等，在這些特殊環境中生活著一類特殊的微生物－嗜冷菌［1］。人們也從許多人工高寒環境(如冷庫、冰箱)中分離到嗜冷菌。由于長期生活在極冷的環境條件下，嗜冷菌在其細胞內形成了多種具有特殊功能的酶，即嗜冷酶，保證其在低溫條件下的生命活力［2］。嗜冷酶不僅具有普通化學催化劑無法比擬的優點，如在低溫條件下催化效率高、底物專一性強，且在中高溫條件下能快速失活，終止酶作用，這對于食品行業上保持食品的品質尤為有利。目前，對嗜冷酶的研究尚處于初期階段，但對嗜冷酶的結構特征、嗜冷機制及應用前景已有一些文獻報道。本文主要對嗜冷酶的特性及其在食品工業上的應用前景做一綜述。

1 嗜冷酶的制備

1.1 利用嗜冷菌和基因工程技術篩選

極端酶的獲得需要對極端微生物進行大規模培養和酶的發酵生產。目前嗜冷酶獲取的常規手段是從天然的嗜冷環境中采集樣品，富集、分離嗜冷菌，再通過特定選擇標記篩選嗜冷酶。實驗室中通常在低溫條件下培養嗜冷菌8～12h，得到較高濃度的細胞和胞外酶，低溫下更多的酶生成相應地加快了酶促反應速率。高溫(＞25℃)雖然縮短了嗜冷菌的生長時間，但細胞濃度低，胞外酶產量少。研究表明大多數嗜冷菌產生的嗜冷酶在低溫條件下依然能保持很高的催化活性，尤其是胞外酶［3］。因此，嗜冷菌依然是目前獲得嗜冷酶最直接，也是最可靠的來源。

但是人們對環境的認識有限，大部分的嗜冷菌還未被培養，且多數嗜冷菌生長速度較慢，發酵條件嚴格，單純通過培養野生菌來獲得大量嗜冷酶極其困難。一般工業生產上直接從嗜冷環境中收集DNA片段，將其隨機切割成限制性片段，然后將目的基因導入宿主細胞中表達。這樣能夠在溫和的培養條件下獲得大量的嗜冷酶，大大縮短時間，提高篩選效率。利用基因重組技術，克隆極端酶的基因，結合序列分析探討酶的結構與功能的關系，是目前極端酶酶學研究的方法之一［4－9］。Feller［10］將兼性嗜冷菌Maraxella TA144的脂肪酶基因導入E.coli中表達，獲得較高的重組脂肪酶活力，且重組酶與野生酶特性相似。因此，把嗜冷酶基因克隆到嗜溫菌中表達，不僅產量高，還能夠較好地保持原有的穩定性。

隨著DNA測序技術的提高，許多嗜冷菌的基因組已經被解析［11－13］。通過與嗜溫菌的已知基因序列比對，可推測得到許多重要的酶蛋白基因序列，對這些基因表達蛋白的研究，將進一步豐富已有的嗜冷酶資源。

1.2 應用定向突變手段篩選

定向進化始于某一基因的克隆，后經體外誘變和重組產生大量的突變體，在中溫宿主中表達后，再篩選得到在低溫條件下有催化活力的突變體。天然酶的使用局限性促進了蛋白質定向進化技術的快速發展，通過定向誘變和定向突變提高常溫酶的穩定性，并對低溫酶進行適當的修飾和改造，從而獲得新的低溫酶是近年來低溫酶生物技術的研究方向。定向進化技術的發展不僅為我們獲得新型酶提供了新思路，豐富了酶類資源，也促進了許多酶類在工業催化中的應用，利用這種方法已得到多種嗜冷酶［14－16］。

此外，利用DNA改組(DNA shuffling)或雜合酶(hybrid enzyme)技術，將相關基因片段任意重組，合成新的基因庫，也有望獲得一些新型嗜冷酶，這些技術促進了現在酶工程的快速發展。

2 嗜冷酶的結構特征及耐受機制

嗜冷酶的主要特性，就是在低溫下的高周轉率(Kcat)和高催化效率(Kcat/Km)［17－18］，這主要受其特殊的結構特征的影響。人們通常采用以下方法研究酶在低溫條件下的結構完整性和催化功能:a.通過自然或誘導突變，將特定殘基發生改變的蛋白與其天然結構比對分析;b.對比同屬嗜溫、嗜熱及嗜冷蛋白的結構，或不同生物中具有不同熱穩定性的相同蛋白的結構［19］。現在普遍認為，嗜冷酶通過特定區域或整個蛋白結構柔順性的提高，降低了自身的活化能，使酶具有較高的底物結合能力，從而降低Km才能在低溫下表現出高催化效率，但高柔韌性結構同樣也引起酶的耐熱性降低。低溫酶松散和開放的結構特性，有助于提高酶分子在催化過程中的構象變化能力，一方面為底物到達酶的活性位點提供更佳的通道和容納位置，提高酶活性位點與底物之間的結合互補性，并有利于產物的釋放;另一方面可降低活化能以補償反應分子的低動能，減少容納龐大底物所耗費的能量，在低能耗情況下保證酶的高催化效率。

酶蛋白的一級結構決定高級結構，因此從理論上講，嗜冷酶一級結構的改變對構象的變化及其耐冷機制起主要作用，其微小的變化就會對溫度非常敏感，足以引起酶的活性、柔韌性和耐熱性的變化，使得底物更容易進入酶活性中心與其結合。嗜冷、嗜溫和嗜熱3種DNA連接酶的三維模型分析顯示，其表面親水殘基含量依次升高(69%、75%、77%)，疏水殘基含量依次降低(22%、18%、17%)，中性氨基酸含量也依次降低(21%、18%、14%)，同時，低溫連接酶活性位點的表面可接觸中性殘基含量(20%)也高于其他兩種連接酶(18%、9%)，表明嗜冷酶氨基酸殘基組成對酶的活性、柔韌性和耐熱性具有綜合影響［20］。豬α－淀粉酶中的21個脯氨酸殘基，在嗜冷酶中有12個發生丟失或被丙氨酸等小分子氨基酸取代［21］;Georlette研究嗜冷、嗜溫和嗜熱菌的谷氨酰脂脫氫酶(glutamate dehydrogenase)、β－內酰胺酶(β－lactamases)和α－淀粉酶(α－amylase)等的氨基酸，發現其中含較少的脯氨酸、精氨酸殘基，脯氨酸與賴氨酸比值也較低;嗜冷磷酸甘油醛異構酶中脯氨酸數量也出現減少［22］。脯氨酸殘基可以減小蛋白非折疊多肽構象的自由程度，它們的減少有助于提高蛋白結構的柔順性;精氨酸含量的減少有利于增強蛋白結構的穩定性，一般表現為精氨酸摩爾比或精氨酸/(精氨酸+賴氨酸)比值的減小［23］。

嗜冷酶的嗜冷機制除與氨基酸的組成及結構有關，還受一些弱鍵(如靜電弱相互作用、離子配位鍵、氫鍵、疏水作用)的影響。靜電弱相互作用可提供蛋白結構穩定所需的凈自由能，離子對(主要為鹽橋)是蛋白構象最穩定的因素。人們研究發現，嗜冷酶中缺乏連接二級結構和蛋白域的表面鹽橋:與豬胰腺淀粉酶相比，低溫α－淀粉酶減少了12個表面鹽橋［24］;從嗜熱、嗜溫到嗜冷丙氨酸脫氫酶，鹽橋數量依次遞減［25］。氫鍵也是穩定蛋白折疊構象的一個重要因素，氫鍵的缺乏減小了非折疊多肽構象的自由程度，提高了蛋白結構的柔順性［26］。芳香族側鏈之間由酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸的芳香環形成的弱極性相互作用，也是穩定蛋白構象的一個重要因素。Feller［10］研究發現嗜熱枯草桿菌蛋白酶、β－內酰胺酶中高度保守的芳香族殘基間的一些芳香族相互作用，在嗜冷酶中消失了;低溫α－淀粉酶中，氨基、氧基及硫基－芳香族相互作用的數量也出現減少。蛋白核心內部由疏水側鏈聚集成簇所形成的疏水核，是穩定蛋白折疊構象的重要力量，其疏水作用可提供蛋白結構穩定所需的凈自由能。與嗜溫酶相比，嗜冷酶的疏水核心簇內發生了取代，疏水作用急劇下降:豬α－淀粉酶中形成疏水簇的84個殘基，在嗜冷酶對應位置上有25個被取代，結果嗜冷酶的疏水能力指數急劇下降，而柔順性參數則上升了72%［10］;低溫β－內酰胺酶、枯草桿菌蛋白酶的整體疏水能力也出現了下降［10］。

此外，溶劑相互作用及表面親水性［27］、具有獨特性質的環狀結構的插入/刪除、蛋白質的折疊、離子束縛作用(如Ca2+)［28］等也對酶的耐熱性有影響。

雖然人們對嗜冷酶進行了一些研究，并且也取得了一些成果，但還不足以徹底闡明酶的結構與耐冷機制之間的關系。從現有的研究結果來看，酶蛋白結構的穩定性、可變性與活性之間的關系是相當復雜的，到目前為止，還沒有在嗜冷酶中發現一種或幾種與耐冷性有關的模式結構，這說明不同酶以不同的結構類型、同種酶以多種結構變化的總和來維持其在低溫條件下的高催化活性。

3 嗜冷酶在食品工業上的應用

目前已有多種嗜冷酶得到了純化或克隆表達，主要有脂肪酶、彈性蛋白酶、丙氨酸脫氫酶、乙醇脫氫酶等。這些低溫酶的特殊性質使其在工業生產應用中具有一些優勢:低溫下催化反應可防止污染(同源的嗜溫酶不活潑);經過溫和的熱處理即可使嗜冷酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會影響產品的品質［29］。這也是低溫酶能夠廣泛應用于生物工程的兩大要素，尤其在食品工業上，不僅對食物的口感和質量有很好的保持作用，且不用擔心酶持續作用改變食物的結構，因此具有較好的應用前景。

3.1 乳制品行業

采用高活性嗜冷β－半乳糖苷酶替代傳統的K.luyveromyces產生的β－半乳糖酶，不但可保持高水平的乳糖水解活性，有效降解奶制品中乳糖含量，消除乳糖不耐癥，還可縮短水解時間，減少細菌污染的風險，提高奶制品的品質。此外還有脂酶、凝乳酶、過氧化氫酶等。脂酶可用于乳制品和黃油的增香，類可可脂的生產及魚油中n－3系多聚不飽和脂肪酸含量的提高。乳酪的加工過程中需用凝乳酶，來源于小牛的凝乳酶價格昂貴，且過高的溫度會影響奶酪的風味，并耗費較多能量，而穩定性較弱的嗜冷菌凝乳酶有助于解決這一問題。在牛奶冷藏的過程中，需要加入過氧化氫進行殺菌，以避免對牛奶中的酶和有益細菌的損害，而過剩的過氧化氫可以用耐冷的過氧化氫酶來分解。此外還篩選出適于低溫條件下(5℃)制作豆奶凝乳的蛋白酶［30］，比采用來自灰菌素鏈霉菌(Streptomycesgriseinus)的微生物蛋白酶處理過的硬度更高，微生物蛋白酶只產生輕微的凝塊活性。

3.2 冷飲行業

低溫果膠酶可用來降低果汁的黏度，使終產品變得澄清;β－淀粉酶可部分代替啤酒工藝中的大麥麥芽，降低了啤酒的生產成本，且提高啤酒的香度［31］;對嗜冷酶蛋白結構和穩定性的研究將有利于食品加工中食品的冷凍成型、冷干和濃縮操作等，有望應用于冰淇淋生產中［32］。

3.3 烘烤面包

嗜冷蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶可與淀粉直接作用，改進面團和面包屑的性質，減少生面發酵時間，提高面包質量，同時還可保持香味和水分。這些低溫酶的優勢不僅體現在其高度專一活性方面，還體現在易失活方面:阻止酶的繼續反應，從而避免了面包瓤結構的改變，不至于使面包變得太軟或太粘。

3.4 肉類加工行業

低溫蛋白酶有助于肉變嫩，因其在低溫下可作用于肉類中的結締組織膠原和彈性硬蛋白，在較低pH狀態(pH4～5)下也具有良好的活性，，是理想的肉類柔嫩酶的潛在來源。木瓜蛋白酶已經被應用于這一方面，但直到目前，還沒有微生物來源的蛋白酶被成功應用于這一方面，這主要是由于作用于結締組織的酶活性太低［33］。由嗜冷微生物獲得的低溫彈性蛋白酶，有可能應用到這方面。

3.5 保健營養品開發

不飽和脂肪酸如PUFA、GLA、EPA及DHA等具有降血脂、降糖、防癌及健腦益智等生理功效，可作為飲食補充物，以補償必需脂肪酸的不足并恢復正常的代謝功能。但受氣候、產地、資源及成本的影響，目前PUFA含量不穩定，不能滿足人們的需求。而微生物發酵產生的酶在低溫條件下可生物催化合成脂肪酸脂，使其擺脫了原料限制，為油源開發提供新途徑。

此外，從嗜堿及嗜冷微球菌(Micrococcussp)中獲得一種α－淀粉酶，此酶在低溫和高pH下可將淀粉轉化為麥芽四糖(mahotetrose)，是一種麥芽寡糖(maho－oligosacch aride)，已被用于食品添加劑和臨床分析。

4 展望

隨著對嗜冷酶的不斷發掘，得到的嗜冷酶種類越來越多，對其特性及應用的研究也越來越深入。就其結構而言，從最初同嗜溫、嗜熱酶之間同源性模型的結構比對到對其自身晶體三維結構的的觀察。目前，許多來源于高山、極地深海等極端環境中的低溫酶，包括谷氨酰脂脫氫酶、α－淀粉酶、β－內酰胺酶、丙氨酸脫氫酶等的一級結構、基因或表達蛋白序列功能特性等方面的信息已被獲悉。嗜冷酶的結構多樣，其嗜冷機制也各不相同，目前尚沒有一種統一的模式結構能很好解釋嗜冷酶的耐冷機制，尤待我們進一步探索。

從應用方面看，雖然自然界賦予嗜冷酶低溫下的高催化活性，且已利用基因工程技術在宿主中得到表達，但酶的表達量畢竟有限，且在高溫下的熱敏感性限制了其在生物技術上的廣泛應用。至今只有一小部分嗜冷酶被分離純化并應用于生產，因此嗜冷酶還有很大的潛在價值。相信隨著越來越多的嗜冷微生物的分離鑒定、嗜冷酶的分離純化及基因工程技術的進一步發展，嗜冷酶將會以更廣闊的來源、更低廉的價格應用到食品行業及其他工業中。

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