Box -Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)藤茶抗氧化活性的最優(yōu)沖泡工藝

王婉瑩，張?chǎng)维帲?偉，郭建軍，許利嘉，* ，肖培根

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193;2.國家教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193;3.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州都勻558003)

藤茶，原植物為葡萄科蛇葡萄屬的顯齒蛇葡萄Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang。俗稱甜樹茶、甜茶藤、田婆茶(廣西)、藤婆茶(廣東連州)、臘梅茶、石花茶(廣東英德)、茅巖霉茶(湖南張家界)、白茶(廣東)、白茶餅、癩痢茶、甘露茶等，是一種應(yīng)用歷史悠久，分布廣泛的類茶植物資源和藥食兩用植物資源［1-5］。其幼嫩莖葉當(dāng)茶泡飲具有清熱解毒、消炎抑菌、止咳利咽、降壓減脂、消除疲勞等功效。藤茶富含黃酮類成分，據(jù)報(bào)道藤茶總黃酮含量可高達(dá)41.2%左右，其中雙氫楊梅素含量可達(dá)30%左右［6-8］。

人體內(nèi)多余的自由基會(huì)引發(fā)氧化損傷，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化，使機(jī)體抵抗力下降，從而導(dǎo)致腫瘤、動(dòng)脈硬化、心腦血管疾病、糖尿病等多種疾病的發(fā)生［9］。現(xiàn)代藥理活性研究表明，藤茶具有極好的抗氧化活性，能夠有效清除自由基［10-11］。并且具有較好的抗腫瘤活性［12］，能明顯降低高脂飲食大鼠血脂，抑制動(dòng)脈粥樣硬化［13-14］，還能提高非特異性免疫功能［15］，在維持機(jī)體正常代謝和疾病防治中起到了非常積極的作用。

目前關(guān)于藤茶的研究多集中于其活性成分分析［15-17］，含量測(cè)定［18-20］，藤茶黃酮工業(yè)提取工藝［21-23］等方面，而藤茶作為日常保健茶飲的沖泡條件的研究鮮有報(bào)道。為了讓藤茶的抗氧化活性在日常沖泡中得到充分有效的利用，本文系統(tǒng)全面的對(duì)日常沖泡藤茶的主要因素進(jìn)行研究，采用單因素和響應(yīng)面分析方法得出最適的沖泡條件，為科學(xué)指導(dǎo)飲用藤茶提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤茶 湖南張家界，2012年 6月產(chǎn);DPPH(1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 美國Sigma公司。

MQX200型酶標(biāo)儀 美國伯騰公司;AL-204型千分之一電子分析天平 美國梅特勒-托利多公司。

1.2 試樣沖泡方法

模擬生活泡茶，以藤茶為樣品，在不同的溫度、次數(shù)、時(shí)間、料液比、水質(zhì)的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分析不同因素對(duì)藤茶茶湯的抗氧化活性的影響，采用DPPH法測(cè)定其抗氧化活性。

1.2.1 沖泡溫度對(duì)藤茶抗氧化活性的影響 稱取1.0g的藤茶，分別加入 60mL、不同溫度(100、90、80、70、60℃)的純凈水，沖泡一次，沖泡時(shí)間為4min，過濾，測(cè)定茶湯的DPPH自由基清除率。

1.2.2 沖泡次數(shù)對(duì)藤茶抗氧化活性的影響 稱取1.0g的藤茶，加入60mL、80℃的純凈水，沖泡4min，過濾后的濾渣繼續(xù)同樣操作的第二次沖泡、第三次沖泡直至第十次沖泡，測(cè)定不同沖泡次數(shù)的茶湯的DPPH自由基清除率。

1.2.3 料液比對(duì)藤茶抗氧化活性的影響 稱取1.0g的藤茶，分別以料液比為 1∶40、1∶50、1∶60、1∶80、1∶100(g/mL)，加入 40、50、60、80、100mL、溫度 80℃ 的純凈水，沖泡4min，過濾，測(cè)定茶湯的DPPH自由基清除率。

1.2.4 沖泡時(shí)間對(duì)藤茶抗氧化活性的影響 稱取1.0g的藤茶，加入60mL、80℃的純凈水，分別沖泡2、4、6、8、10min，過濾，測(cè)定茶湯的 DPPH 自由基清除率。

1.2.5 水質(zhì)對(duì)藤茶抗氧化活性的影響 稱取1.0g的藤茶，分別加入60mL、80℃的娃哈哈桶裝礦泉水、雀巢瓶裝礦泉水、自來水、純凈水和超純水沖泡一次，沖泡時(shí)間為4min，過濾，測(cè)定茶湯的DPPH自由基清除率。

1.3 DPPH法測(cè)定抗氧化活性

DPPH分析法因其能準(zhǔn)確、快速、簡便地測(cè)定自由基清除能力而被廣泛用于測(cè)定生物試樣、酚類物質(zhì)和食品等的抗氧化能力。本文參照Miliauskas［24］等的研究方法，略有改進(jìn)。將2mL的2×10-4mol·L-1的DPPH無水乙醇溶液與2mL過濾后的藤茶茶湯混合，搖勻，室溫，暗室反應(yīng)30min。以無水乙醇調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)517nm波長處吸光度(A1)，同時(shí)測(cè)定2mL樣液與2mL無水乙醇混合液的吸光度(A2)，2mL無水乙醇與2mL DPPH醇溶液混合液的吸光度(A0)。每組平行測(cè)定三次，取平均值即為樣品對(duì)DPPH自由基的清除率。計(jì)算公式為:清除率(%)=［1-(A1-A2)/A0］×100。結(jié)果以DPPH自由基清除率表示，清除率越高，樣品清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)。

1.4 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)優(yōu)化藤茶沖泡工藝

采用Design Expert 8.0，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取沖泡溫度、沖泡時(shí)間和料液比三個(gè)因素，以藤茶抗氧化活性DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法對(duì)藤茶的日常沖泡工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 沖泡溫度對(duì)藤茶抗氧化活性的影響 由圖1可知，60～80℃的藤茶茶湯DPPH自由基清除率隨溫度的升高而增加明顯，溫度高于80℃后，DPPH自由基清除率有所下降，100℃時(shí)DPPH自由基清除率再次回升，但DPPH自由基清除率的最高值出現(xiàn)在80℃。原因可能是藤茶采用嫩葉嫩芽加工而成，水溫較低時(shí)，抗氧化的有效成分溶出量較少，活性較差。而水溫超過80℃后，藤茶嫩葉嫩芽的表面易熟化、結(jié)膜，可能阻礙了部分抗氧化有效成分的溶出，100℃時(shí)抗氧化活性再次有所升高，推測(cè)可能原因是藤茶中的某些抗氧化有效成分在此溫度下溶出增加。考慮到高溫條件下，維生素C等有益成分易遭破壞，且DPPH自由基清除率的最高值出現(xiàn)在80℃，選取80℃為最適溫度。

圖1 溫度對(duì)藤茶抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of temperature on the DPPH radical scavenging rate of vine tea

2.1.2 沖泡次數(shù)對(duì)藤茶抗氧化活性的影響 由圖2可知，僅沖泡一次時(shí)，藤茶的抗氧化活性最低，推測(cè)是因?yàn)槠淇寡趸钚猿煞秩艹鲚^少所致。沖泡兩次之后，藤茶的抗氧化活性隨沖泡次數(shù)增加而升高，直至沖泡9次時(shí)抗氧化活性達(dá)到最高，第10次開始下降。可見藤茶多次沖泡后抗氧化活性仍然很高。這與民間使用藤茶的經(jīng)驗(yàn)相契合:民間形容藤茶茶湯“經(jīng)久不餿”，放置數(shù)天仍能飲用。但沖泡次數(shù)超過四次，茶湯口感明顯變差，可能是因?yàn)槎啻螞_泡后氨基酸、維生素C等成分的溶出量減少［25］所致。綜合考慮，沖泡次數(shù)可按個(gè)人喜好選擇，3～9次為宜。

2.1.3 料液比對(duì)藤茶抗氧化活性的影響 由圖3可知，1∶40～1∶60g/mL 時(shí)，隨著料液比的增加，藤茶的抗氧化活性明顯增加，料液比1∶60時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到最高值，隨后呈下降趨勢(shì)。推測(cè)原因可能為，在相同的溫度和時(shí)間下，水量過少，有效成分不能充分溶出。水量過大，溶劑比例增加對(duì)溶出物和藤茶抗氧化的主要有效成分起到了一定的稀釋作用，同時(shí)也影響口感，綜合考慮，選擇1∶60為最適料液比。

圖3 料液比對(duì)藤茶抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the DPPH radical scavenging rate of vine tea

2.1.4 沖泡時(shí)間對(duì)藤茶抗氧化活性的影響 由圖4可知，藤茶的抗氧化活性隨著時(shí)間的增加，整體呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，且在6min達(dá)到最大值。藤茶的有效物質(zhì)隨著沖泡時(shí)間延長而溶出量逐漸增大，但時(shí)間過長可能使部分有效成分被氧化，導(dǎo)致藤茶的抗氧化活性反而降低，10min時(shí)抗氧化活性又再次稍有上升可能是因?yàn)橛衅渌镔|(zhì)溶出。考慮到抗氧化活性、口感等綜合因素，選擇6min為最適時(shí)間。

2.1.5 水質(zhì)對(duì)藤茶抗氧化活性的影響 由圖5可知，自來水沖泡的抗氧化活性最低，主要因?yàn)樽詠硭写温人岬膹?qiáng)氧化性氧化了藤茶中的有效成分，再者自來水中的礦物質(zhì)和雜質(zhì)也較多，降低了藤茶的抗氧化活性。娃哈哈桶裝礦泉水和雀巢瓶裝礦泉水的效果也較差，可能是礦泉水中的礦物質(zhì)和其他雜質(zhì)與藤茶中的有效成分發(fā)生反應(yīng)而降低其抗氧化活性。純凈水和超純水的抗氧化最好，但考慮到超純水較難應(yīng)用于日常生活，故選擇純凈水為最適宜的水質(zhì)。

圖4 沖泡時(shí)間對(duì)藤茶抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of time on the DPPH radical scavenging rate of vine tea

圖5 水質(zhì)對(duì)藤茶抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of water on the DPPH radical scavenging rate of vine tea

2.2 響應(yīng)面分析及驗(yàn)證

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取沖泡溫度、沖泡時(shí)間和料液比三個(gè)因素，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)三因素各取三水平，設(shè)計(jì)了三因素三水平共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，以三因素為自變量，藤茶DPPH自由基清除率為響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance

經(jīng)二次多項(xiàng)式回歸擬和得到各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)面影響的回歸方程為:藤茶DPPH自由基清除率(%)=+86.47-0.94×C+0.54×A×B-0.65×A×C+1.81×B×C-2.17×A2-1.86×B2-3.06×C2

2.2.2 響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各因素(A、B、C)所構(gòu)成三維空間的曲面圖，根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖，體現(xiàn)了在第三個(gè)變量保持最佳水平時(shí)，另兩個(gè)獨(dú)立變量之間的交互關(guān)系。結(jié)果見圖6～圖8。曲面圖直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，圖6，圖7和圖8表明溫度、時(shí)間和料液比與藤茶茶湯的DPPH自由基清除率均呈二次方程關(guān)系。圖中等高線形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表明交互作用不顯著，圖6，圖7，圖8的等高線圖表明，溫度、時(shí)間和料液比三者之間均有交互作用，交互作用的影響可能導(dǎo)致響應(yīng)面預(yù)測(cè)最佳值與單因素最佳值相對(duì)偏移。

圖6 溫度和時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of temperature and time on the DPPH radical scavenging rate of vine tea

圖7 溫度和料液比對(duì)DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of temperature and solid-liquid ratio on the DPPH radical scavenging rate of vine tea

圖8 時(shí)間和料液比對(duì)DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of time and solid-liquid ratio on the DPPH radical scavenging rate of vine tea

由響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到藤茶抗氧化活性最好時(shí)的最適沖泡條件為:溫度80.17℃，時(shí)間5.83min，料液比1∶56.42，此條件下預(yù)測(cè)的 DPPH自由基清除率為86.56%。為實(shí)際操作方便，修正條件為溫度80℃，時(shí)間5.8min，料液比1∶56，在此修正條件下進(jìn)行三次平行的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得到實(shí)際的DPPH自由基清除率為86.49%，與預(yù)測(cè)值86.56%非常接近。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，模擬日常實(shí)際沖泡條件，采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了沖泡溫度、沖泡次數(shù)、單次沖泡時(shí)間、料液比和水質(zhì)五個(gè)因素對(duì)藤茶抗氧化活性的影響。以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析，研究沖泡時(shí)間、沖泡溫度和料液比三個(gè)自變量的交互作用及其對(duì)藤茶抗氧化活性的影響，模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型，并確定了日常沖泡藤茶時(shí)抗氧化活性最佳的條件為:1g藤茶，加56mL溫度為80℃的水，沖泡5.8min，此時(shí)藤茶DPPH自由基的清除率可達(dá)86.49%，藤茶的抗氧化活性達(dá)到最佳。按此條件沖泡，藤茶能夠發(fā)揮更理想的抗氧化作用。

［1］廣西植物研究所.廣西藥用植物名錄［M］.南寧:廣西民族出版社，1974.

［2］全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編下冊(cè)［M］.北京:人民出版社，1978.

［3］張友勝，寧正祥，楊偉麗.藤茶學(xué)［M］.廣州:廣東科技出版社，2003.

［4］許利嘉，馬培，肖偉，等.別樣茶-藤茶的古今應(yīng)用歷史初步調(diào)查［J］.中國現(xiàn)代中藥，2012，14(4):62-66.

［5］張友勝，楊偉麗，熊浩平.類茶植物顯齒蛇葡萄的研究利用現(xiàn)狀［J］.茶葉通訊，2001，(1):19-23.

［6］薛慧.恩施來鳳藤茶微量元素的分析及其保健功能探討［J］.廣東微量元素科學(xué)，2004，11(8):56-58.

［7］張友勝，楊偉麗，熊皓平.顯齒蛇葡萄基本成分研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13(5):46-48.

［8］何桂霞，裴剛，周天達(dá)，等.顯齒蛇葡萄中總黃酮和二氫楊梅素的含量測(cè)定［J］.中國中藥雜志，2000，25(7):423-425.

［9］Marx J L.Oxygen free radicals linked to many diseases［J］.Science，1987，5:235-238.

［10］唐瑛.藤茶總黃酮的體外抗氧化作用研究［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26(12):1449.

［11］何桂霞，杜方麓，楊偉麗，等.藤茶總黃酮清除自由基與抗脂質(zhì)過氧化作用［J］.中藥材，2003，26(5):338-340.

［12］鄭作文，郭成賢，毛健，等.藤茶總黃酮對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20(5):1158-1159.

［13］鐘正賢，陳學(xué)芬，周桂芬，等.廣西產(chǎn)藤茶總黃酮的藥理研究［J］.廣西科學(xué)，1999，6(3):216-218.

［14］陳曉軍，陳學(xué)芬，李茂，等.顯齒蛇葡萄總黃酮降脂作用的研究［J］.廣西中醫(yī)藥，2001，24(5):52-54.

［15］閻莉，鄭作文，衛(wèi)智權(quán).廣西藤茶總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫功能的影響［J］.中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2009，6(2):65-67.

［16］覃潔萍，許學(xué)健，李劍江，等.廣西瑤族藤茶化學(xué)成分的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1997，9(4):41-43.

［17］張友勝，楊偉麗，崔春.顯齒蛇葡萄化學(xué)成分的研究［J］.中草藥，2003，34(5):402-403.

［18］熊皓平，楊偉麗，何國慶，等.分光光度法測(cè)定顯齒蛇葡萄總黃酮含量［J］.食品科學(xué)，2004，25(2):144-145.

［19］田森林，張友勝，楊英雄，等.反相高效液相色譜法測(cè)定顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素的含量［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2002，28(1):32-34.

［20］張友勝，楊偉麗，熊皓平.RP-HPLC法測(cè)定顯齒蛇葡萄植物中楊梅素的含量［J］.中草藥，2001，32(11):983-985.

［21］李衛(wèi)，寧正祥.逆流法提取二氫楊梅素研究［J］.食品科學(xué)，2004，25(11):192-194.

［22］楊鈴，鄭成，寧正祥.正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選二氫楊梅素的提取工藝［J］.食品工業(yè)科技，2005，26(5):95-97.

［23］羅祖友，楊曉萍，吳謀成.藤茶水溶性多糖及總黃酮的提取工藝研究［J］.食品科學(xué)，2005，26(5):156-160.

［24］Miliauskas G，Venskutonis P R，van Beek T A.Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts［J］.Food Chemistry，2004，85:231-237.

［25］胡迎芬，杭瑚.飲茶方式對(duì)茶湯有效成分含量的影響［J］.食品工業(yè)科技，2002，23(2):27-29.