木瓜蛋白酶制備山杏源降糖肽工藝優化研究

王 晟，崔 潔，顧 欣，張喬會，王建中

(北京林業大學生物科學與技術學院，北京100083)

糖尿病已經成為繼腫瘤、心腦血管疾病之后的第三大人類殺手，其中多為Ⅱ型糖尿病［1］，目前口服使用的阿卡波糖等降血糖藥物存在著價格昂貴和有惡心嘔吐等不良反應的缺陷［2］。具有降血糖功效的天然產物很好地彌補了這些缺陷，其中多為多糖類，如苦瓜多糖、桑黃多糖、地參多糖等［3－4］。多肽類降血糖產物也逐漸成為研究熱點，已經有苦瓜肽、人參多肽、靈芝肽、鯊魚肝肽等被證明有降血糖活性［5－9］。山杏仁含27%的蛋白質，氨基酸種類齊全，平衡合理，是一種優良的植物源蛋白質［10］，榨油之后的山杏仁粕更是蛋白含量高達41.60%［11］，而這些山杏仁粕卻常常被直接丟棄，沒能得到充分利用。木瓜蛋白酶具有耐高溫、活性強、穩定性好等特點［12］，在多肽研究中是一種常用的酶。劉雪峰［13］等的研究表明杏仁肽具有降血糖活性，但原料和所使用的酶都和本研究不一樣。本研究使用木瓜蛋白酶水解脫脂山杏仁粕，探究制備具有降血糖活性的肽的工藝條件，為山杏仁粕的進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

脫脂山杏仁粕 河北省平泉縣;木瓜蛋白酶(50萬 U/g)、α－葡萄糖苷酶、4－硝基苯－α－D－吡喃葡萄糖苷(PNPG)Sigma Chem.Co.;其余試劑 均為分析純。

FD－1冷凍干燥機 北京德天佑科技發展有限公司;D－37520Osterode型冷凍離心機 Thermo Scientific;Model 680 Microplate reader酶標儀 BIORAD;HHS4型恒溫水浴鍋 上海浦東躍新科學儀器廠;PHS－25型pH計 上海精密科學儀器有限公司;氣引式粉碎機 日本佑崎有限公司;SHZ－D循環水式多用真空泵 上海振捷實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫脂 將脫脂山杏仁粕粉碎后用石油醚浸泡，每天更換石油醚反復多次直至脫脂徹底。抽濾除去石油醚后，置于通風櫥中靜置晾干，過80目篩，于4℃保存備用。

1.2.2 蛋白質的提取 堿提酸沉法提蛋白［14］，具體工藝流程如下:脫脂山杏仁粉→堿提(液料比14∶1，37℃，60min，pH9.0)→離心(4000r/min，20min)→上清液→酸沉(pH4.1)→離心(5000r/min，15min)→沉淀→復溶(調pH至中性)→冷凍干燥→山杏仁蛋白粉

1.2.3 酶解條件

1.2.3.1 單因素實驗 在其他條件一定的情況下，分別對 pH(5、6、7、8、9)、酶解時間(1、2、3、4、5、6、7、8h)、溫度(40、45、50、55、60℃)、加酶量(1%、2%、3%、4%、5%、6%)、料液比(1、3、5、7、9)進行單因素實驗，基本條件為pH7.0，時間6h，溫度50℃，加酶量3%，料液比5%，每個實驗重復3次。

1.2.3.2 響應面法實驗 在單因素實驗的基礎上，使用Design－Expert 7.1.5軟件，根據Box－Behnken中心組合實驗設計原理［15］，設計四因素三水平的響應面實驗，以對α－葡萄糖苷酶抑制活性為指標，對酶解條件進行優化。因素水平表見表1。

表1 響應面分析因素及水平表Table 1 Analytical factors and levels for Box－Behnken

1.2.4 α－葡萄糖糖苷酶抑制率的測定 采用分光光度法進行測定，以PNPG為底物，通過α－葡萄糖苷酶酶解反應會釋放出硝基苯酚，在400nm處有最大吸光度，可以根據這一特性測定樣品對α－葡萄糖苷酶的抑制活性［16］。

配制25mg/mL的α－葡萄糖苷酶溶液、0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.7)和0.9133mg/mL的PNPG，在96孔酶標板每個小孔中依次加入緩沖液、樣品溶液、PNPG和酶溶液，混勻后在37℃條件下反應1h，然后加入50μL碳酸鈉溶液(0.67mol/L)終止反應，在400nm下用酶標儀測定吸光度值。測定反應體系如表2所示。

抑制率計算公式為:

其中，A空白、A樣品、A樣品對照分別為空白組、樣品組和樣品對照組對應的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 酶解時間對產物活性的影響 酶解時間對產物α－葡萄糖苷酶的抑制率影響如圖1所示。從圖1可以看出，產物對α－葡萄糖苷酶的抑制活性在6h時達到最高點，比3～5h的產物抑制率提高了1.5%左右(p＜0.01)。6h后抑制活性呈下滑趨勢。這可能是由于在底物蛋白中包含可溶性蛋白和不溶性蛋白，可溶性蛋白水解時，最初階段敏感性肽鍵快速斷裂，不敏感肽鍵后來斷裂;在不溶性底物蛋白的酶水解中，酶吸附在不溶性蛋白表面，首先水解稀疏結合的不溶性蛋白上的聚合肽，然后再慢慢水解中心的肽鍵［17］。6h后活性肽被過度酶解，結構遭到破壞所致。因此，木瓜蛋白酶最佳酶解時間應控制在6h左右。

圖1 時間對產物活性的影響Fig.1 Effect of time on the inhibition ratio

2.1.2 pH對產物活性的影響 pH對產物α－葡萄糖苷酶的抑制率影響如圖2所示。從圖2可以看出，pH為7時酶解產物對α－葡萄糖苷酶的抑制活性達到最高點。pH小于7或大于7時，酸堿條件會影響酶的活性和底物的構象［18］。因此，木瓜蛋白酶酶解工藝的最佳pH應在7左右。

圖2 pH對產物活性的影響Fig.2 Effect of pH on the inhibition ratio

2.1.3 溫度對產物活性的影響 溫度對產物α－葡萄糖苷酶的抑制率影響如圖3所示。由圖3可知，溫度為50℃時，酶解產物的抑制活性達到最高，溫度繼續升高，酶的活性受到抑制，即有活性的酶減少，影響酶解速度。因此，在本實驗條件下，酶解溫度選擇50℃左右。

2.1.4 加酶量對產物活性的影響 加酶量對產物α－葡萄糖苷酶的抑制率影響如圖4所示。由圖4可知，加酶量為2%時，酶解產物的抑制活性達到最高點，高于2%時，酶含量較高，但因為底物相對較少，產物抑制活性不會再增加。在本實驗條件下，最佳加酶量選擇2%。

2.1.5 料液比對產物活性的影響 料液比對產物α－葡萄糖苷酶的抑制率影響如圖5所示。由圖5可知，料液比在7%時，產物的抑制活性達到最高點，大于7%后，抑制率反而呈下降趨勢。這可能是因為植物蛋白中含有植物蛋白酶抑制劑，能與蛋白酶作用與底物共享蛋白酶的結合基團，表現出競爭性抑制作用［18］。因此，最佳料液比選擇7%。

表2 α－葡萄糖苷酶抑制率檢測反應體系的組成Table 2 The composition of α－glycosidase enzyme inhibition testing system

圖3 溫度對產物活性的影響Fig.3 Effect of temperature on the inhibition ratio

圖4 加酶量對產物活性的影響Fig.4 Effect of enzyme amount on inhibition ratio

圖5 料液比對產物活性的影響Fig.5 Effect of sample to solution ratio on inhibition ratio

2.2 響應面法對酶解工藝的優化

2.2.1 響應面分析結果 依據設計結果進行響應面實驗，結果見表3。

采用Design－Expert 7.1.5軟件程序對實驗數據進行二次多元回歸擬合，分析結果得出木瓜蛋白酶酶解山杏蛋白的回歸方程為:

對上述回歸模型進行方差分析，分析結果見表4。結果表明模型是極顯著的(p＜0.0001)，回歸方程的決定系數是0.9889，說明該模型能夠解釋98.89%的變化，因此可以用此模型對該實驗進行分析和預測。一次項中，A、B、C 影響極顯著，平方項 A2、B2影響極顯著，而交互項的影響相對較小。各因素對酶解所得山杏肽活性影響的大小順序為:pH＞溫度＞加酶量＞料液比。

表3 響應面實驗結果Table 3 Results of Box－Behnken

2.2.2 響應面分析 根據回歸方程，作出響應面圖，見圖6～圖11。

圖6 pH與溫度的交互作用影響的響應曲面Fig.6 Responsive surfaces of pH and temperature

考察響應曲面，可以進一步得出結論，四個因素中對酶解液降糖活性影響最大的是pH，溫度次之，加酶量和料液比的影響較小，四個因素之間的交互影響較小。

表4 響應面回歸模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

圖7 pH與加酶量的交互作用影響的響應曲面Fig.7 Responsive surfaces of pH and enzyme amount

圖8 pH與料液比的交互作用影響的響應曲面Fig.8 Responsive surfaces of pH and sample to solution ratio

圖9 溫度與加酶量的交互作用影響的響應曲面Fig.9 Responsive surfaces of temperature and enzyme amount

圖10 溫度與料液比的交互作用影響的響應曲面Fig.10 Responsive surfaces of temperature and sample to solution ratio

2.2.3 最佳酶解工藝條件的確定 為了確定最佳工藝條件，利用軟件對工藝條件進行優化，得到的山杏肽最佳酶解條件為:pH6.88，溫度49.49℃，加酶量3%，料液比6，在此條件下，產物抑制活性的預測值為14.15%。為了實際操作方便，將酶解工藝條件修正為:pH7，溫度50℃，加酶量3%，料液比6。在此條件下進行三次平行實驗，求平均值得到酶解產物對α－葡萄糖苷酶的抑制活性為14.22%，高于預測值0.07%。將此條件下得到的酶解液凍干，測定其IC50值，結果為0.08g/mL。證明響應面法對木瓜蛋白酶酶解山杏仁蛋白制備α－葡萄糖苷酶抑制肽條件的優化結果準確可靠，有實用價值。

圖11 加酶量與料液比的交互作用影響的響應曲面Fig.11 Responsive surfaces of enzyme amount and sample to solution ratio

3 結論

在單因素實驗的基礎上，利用響應面法優化木瓜蛋白酶酶解山杏仁蛋白制備α－葡萄糖苷酶抑制肽的工藝參數，獲得的最佳工藝條件為:pH7，溫度50℃，加酶量3%，料液比6，在此條件下產物的抑制率為14.22%。

植物蛋白的天然成分對疾病有著獨特的功效卻沒有人工合成藥物的副作用［19］，本實驗還可以進行進一步的深入研究:對酶解產物進行分離純化、結構鑒定，以得到已知結構的純品;還可以對產物進行產品開發，如功能性飲料等。

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