人參脂溶性成分提取工藝優化及其GCMS分析

劉婷婷，劉鴻鋮，樊紅秀，王大為

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118)

人參(Panax ginseng C.A.Mey)是五加科多年生草本植物，具有大補元氣、補脾益肺、復脈固脫、生津安神等功效［1-3］。人參脂溶性成分包括脂肪酸及酯類、甾醇類、聚乙炔醇化合物及揮發油等，據有關文獻報道［4］，人參脂溶性成分具有消炎、鎮咳、降壓、抗疲勞、抗腫瘤、降低膽固醇含量以及興奮中樞神經的作用。人參脂溶性成分的傳統提取方法主要有水蒸氣蒸餾法和有機溶劑浸取法［5］，但水蒸氣蒸餾法加熱溫度高，提取時間長，所得產品的成分往往會發生變化，也可能變味［6］;而有機溶劑浸取法往往會帶來嚴重的溶劑殘留問題［7］。超臨界流體萃取技術(Supercritical Fluid Extraction，SFE)是近年來迅速發展的一種新型綠色分離技術，在功能性油脂的開發利用上已成為熱點領域之一［8］。目前利用超臨界CO2萃取人參脂溶性成分的相關報道較少，因此，本研究以5年人工種植人參為原料，應用超臨界CO2萃取技術提取人參中的脂溶性組分，采用單因素實驗考察超臨界萃取壓力、萃取溫度、萃取時間以及夾帶劑用量對脂溶性成分萃取率的影響，并通過正交實驗對萃取工藝條件進行優化。將萃取物甲酯化后，采用GC-MS對其化學成分進行分析與鑒定，為人參脂溶性成分的開發利用提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參 吉林省白山市撫松縣露水河鎮5年人工種植參，粉碎后過0.84mm(20目)孔徑篩備用;二氧化碳(CO2含量為99.9%，食品級) 長春氧氣廠;正己烷(色譜純) 天津市福晨化學試劑廠;無水乙醇、氫氧化鉀、甲醇、無水硫酸鈉均為分析純 北京化工廠。

HA121-50-02超臨界萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司;GCMS-QP2010氣相色譜質譜儀(配有GC-MS Real Time Analysis工作站，NIST107美國標準數據庫) 日本島津公司;FZ102型微型植物粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;GB1302電子精密天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;101A-2E電熱鼓風干燥箱 上海實驗儀器廠有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 超臨界CO2萃取人參脂溶性成分單因素實驗考察 稱取100g過0.84mm(20目)孔徑篩的干燥人參粉投入萃取罐中，設定分離釜I和分離釜II的壓力為6MPa，溫度為35℃，控制CO2流量為12L/h，無水乙醇從夾帶劑罐中加入，進行動態萃取。萃取到設定時間后，從分離釜I和分離釜II收集萃取物。萃取物經真空旋轉蒸發除去乙醇后，得到棕紅色具有特殊香味的油狀物，將油狀物轉移到平皿中，置于干燥器內，用無水硫酸鈉脫水，備用。根據式(1)計算人參脂溶性成分萃取率。

萃取率(%)=(原料的脂肪含量-萃余物的脂肪含量)/原料的脂肪含量×100 式(1)

設定萃取壓力25MPa、萃取溫度40℃、萃取時間3h、原料/夾帶劑(g/mL)為1∶0.6，單因素實驗為固定其他因素，研究某因素對人參脂溶性成分萃取率的影響，各因素水平為:萃取壓力分別為15、20、25、30MPa;萃取溫度分別為35、40、45、50℃;萃取時間分別為 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h;原料/夾帶劑(g/mL)分別選擇 1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1。

1.2.2 超臨界CO2萃取條件的正交優化 根據單因素實驗的結果進行正交優化實驗，每次裝料100g，選擇萃取壓力(MPa)、萃取溫度(℃)、萃取時間(h)和原料/夾帶劑(g/mL)為考察因素，以人參脂溶性成分萃取率為考察指標，進行四因素三水平正交實驗，確定超臨界CO2萃取的最佳工藝條件，實驗的各因素水平見表1。

表1 正交實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design test

每組實驗在相同的條件下平行3次，以降低實驗操作過程所產生的誤差，數據均以“平均值±標準差”表示，利用SPSS 16.0方差分析對組間和組內差異進行比較，p＜0.05時為差異顯著，p＜0.01時為差異極顯著。

1.2.3 萃取物中人參脂溶性成分的GC-MS分析

1.2.3.1 樣品甲酯化 稱取人參脂溶性成分50mg，置于試管中，加入5mL正己烷，混合使之溶解，再加入0.8mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液2mL，混勻，于30℃恒溫水浴15min，取出靜置后分層，加入無水硫酸鈉脫水后，取上層正己烷相進行GC-MS分析。

1.2.3.2 GC-MS分析條件 色譜條件:色譜柱:HP-5ms石英毛細管柱(30m ×0.25mm ×0.25μm);進樣口溫度:250℃;升溫程序:從80℃開始，先以10℃/min升至200℃，然后以1℃/min升至220℃，再以8℃/min升至280℃，維持3min;載氣為高純度氦氣，流速為1mL/min;進樣方式為分流進樣，分流比50∶1，進樣量1μL。

質譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量70eV;接口溫度250℃;離子源溫度230℃;四級桿溫度150℃;溶劑延時4min;倍增器電壓1300V;質量掃描范圍 m/z 40～600。

2 結果與分析

2.1 超臨界CO2萃取人參脂溶性成分單因素實驗

2.1.1 萃取壓力的影響 通過單因素方差分析，可知萃取壓力對人參脂溶性成分萃取率的影響達到極顯著水平(p＜0.01)，說明萃取壓力是影響萃取的一個重要因素。由圖1可以看出，在萃取壓力為15～25MPa范圍內，隨著萃取壓力的升高，萃取率顯著提高(p＜0.01)。這是由于萃取壓力增大不但會增加超臨界CO2的密度，還會減少分子間的傳質距離，增加溶質和溶劑的傳質效率［9］;但當萃取壓力由25MPa升到30MPa時，萃取率提高不顯著(p＞0.05)，這是因為高壓下CO2密度增大，粘度也較大，傳質性能變差［10］，而且過高的萃取壓力對設備的使用壽命不利［11］。綜合考慮，最佳萃取壓力選用25MPa。

圖1 萃取壓力對人參脂溶性成分萃取率的影響Fig.1 Effect of extraction pressure on the yield of lipid-soluble components in Panax ginseng

2.1.2 萃取溫度的影響 通過單因素方差分析可知，萃取溫度對萃取率的影響達到極顯著水平(p＜0.01)，說明萃取溫度也是影響萃取的一個重要因素。由圖2可以看出，萃取率先隨溫度升高而增加，40℃時達到最大，隨后下降。溫度對超臨界CO2流體溶解能力影響比較復雜，一方面，溫度的升高能提供克服萃取組分解離時動能勢壘必需的熱能，導致溶質的揮發度增大，擴散系數增大，對萃取有利;另一方面，溫度的升高導致超臨界CO2的密度降低，從而直接影響超臨界CO2的溶解能力［12］。因此，最佳萃取溫度選用40℃。

圖2 萃取溫度對人參脂溶性成分萃取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of lipid-soluble components in Panax ginseng

2.1.3 萃取時間的影響 由圖3可以看出，在最初階段，萃取率隨萃取時間的延長而顯著增加;而當萃取時間超過3h時，萃取曲線上升幅度變小，幾乎成為一條水平直線，此時繼續延長萃取時間，也幾乎無萃取物流出。這是由于萃取初始階段，超臨界CO2僅對物料顆粒表面的有效成分進行萃取，內擴散阻力較小，因此開始階段萃取效率比較高;隨著萃取時間的延長，超臨界CO2擴散入固態物料內部進行萃取，內擴散阻力逐漸增大，降低了傳質速率，故萃取效率逐漸降低［13］，而且時間增加也會增加能耗，因此最佳萃取時間選擇3h。

2.1.4 夾帶劑用量的影響 通過預實驗發現，不加夾帶劑時，人參脂溶性成分的提取效果很差，加入乙醇可得到滿意的效果。這是由于物料中脂溶性成分含量很低，極少的溶質被包埋在固體介質內部，增大了超臨界流體的傳質阻力，并且提取出的少量的脂溶性成分極易粘附在管道中和分離釜罐中，難以接出。加入夾帶劑一方面可以提高超臨界流體的溶解性能［14］，另一方面可以將粘附在管道中的溶質攜帶入分離釜中，提高萃取率。

圖3 萃取時間對人參脂溶性成分萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of lipid-soluble components in Panax ginseng

由圖4可以看出，當原料/夾帶劑(g/mL)大于1∶0.6時，萃取率隨夾帶劑用量的增加而顯著增加(p ＜0.01);而當原料/夾帶劑(g/mL)小于1∶0.6時，萃取率隨夾帶劑用量的增加而變化不顯著(p＞0.05)，因此，最佳的原料/夾帶劑(g/mL)選用1∶0.6。

圖4 料液比對人參脂溶性成分萃取率的影響Fig.4 Effect of the ratio of material to entrainer on the yield of lipid-soluble components in Panax ginseng

2.2 正交實驗結果

正交實驗結果如表2所示。根據表2中的R值可以看出，各因素對超臨界CO2萃取人參脂溶性成分萃取率的影響程度依次為A＞C＞B＞D，即萃取壓力的影響最大，萃取時間次之，再次為萃取溫度和原料/夾帶劑(g/mL)。由表3的方差分析結果可知，萃取壓力和萃取時間對萃取率的影響達到極顯著水平(p＜0.01)，而萃取溫度和原料/夾帶劑(g/mL)對萃取率影響不顯著(p＞0.05)，這一結果與極差分析結果一致。最優方案為A2B2C3D2，即萃取壓力25MPa、萃取溫度40℃、萃取時間3.5h、原料/夾帶劑(g/mL)1∶0.6。在此優化工藝條件下進行3次驗證實驗，得到人參脂溶性成分的萃取率為85.38% ±3.16%，超過曹立軍等［15］報道的超臨界萃取法提取人參油的萃取率。

2.3 超臨界CO2萃取人參脂溶性成分的GC-MS分析

采用GC-MS法對超臨界萃取物進行分析，得其總離子流圖見圖5。經質譜數據庫(NIST107)檢索和人工譜圖解析，鑒定出的超臨界萃取物的化學成分見表4。

表2 L9(34)正交實驗結果與極差分析Table 2 Result of L9(34)orthogonal experiment and range analysis

由表4可以看出，從萃取物中共鑒定出28種化合物。脂肪酸類鑒定出13種(82.39%)，其中不飽和脂肪酸8種(68.64%);甾醇類成分鑒定出2種(2.89%);酯類成分2種(2.23%);倍半萜類化合物5種(1.39%);烯烴類成分2種(1.23%)。另外，還有二十八烷等烷烴類成分(0.37%)，桉油烯醇等高級烯醇類成分(0.28%)，己醛二乙縮醛等縮醛類化合物(0.17%)以及生育酚(0.43%)。萃取物中含量較高的成分為亞油酸(43.12%)、順-6-十八碳烯酸(21.65%)、棕櫚酸(11.86%)、5-烯-3-醇-豆甾醇油酸酯(2.02%)、豆甾醇(1.75%)和菜油甾醇(1.14%)。在所鑒定的成分中，己醛二乙縮醛、桉油烯醇、17-三十五碳烯、5-烯-3-醇-豆甾醇油酸酯和壬酸等5種化合物在前人相關研究文獻中未見報道。

表3 正交實驗方差分析結果Table 3 Result of analysis of variance for orthogonal design test

表4 SFE法萃取人參脂溶性成分的GC-MS分析Table 4 GC-MS analysis of the lipid-soluble components from Panax ginseng by SFE

圖5 SFE法提取人參根脂溶性成分的總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatogram of the lipid-soluble components from Panax ginseng by SFE

魏建華等［16］采用超臨界CO2萃取法萃取人參脂溶性成分，從中鑒定出44種化學成分，但不含有本研究鑒定出的β-丁香烯、白菖烯、α-古蕓烯、γ-欖香烯、桉油烯醇、豆甾醇、菜油甾醇、角鯊烯、生育酚等生物活性成分。分析造成鑒定結果出現差異的原因，一方面可能與樣品甲酯化前處理方式和計算機質譜圖庫的限制有關，另一方面可能與人參產地不同有關。

張秀麗［17］等采用乙醚回流法提取人參脂溶性成分，并鑒定出較高含量的醇類、脂肪酸及酯類成分，以及少量的醛類、烴類、萜類成分。Richter［18］、楊艷輝［19］等采用水蒸汽蒸餾法提取的人參脂溶性成分以萜烯及其含氧衍生物、烷烴、烯、醛、酮類為主［20］。本研究采用的超臨界CO2萃取法由于具有強溶解能力和高選擇性，能將一些高沸點、脂溶性成分一并提取出來，得到的人參脂溶性成分中富含不飽和脂肪酸、甾醇類化合物、酯類和倍半萜類，但未含有倍半萜烯類的含氧衍生物，這是由于超臨界萃取過程完全密閉而且萃取溫度較低，排除了一些化學成分遇氧氧化及見光反應的可能性。超臨界CO2萃取法提取時間短、無溶劑污染，并且萃余物仍可作為提取皂苷、多糖以及膳食纖維的良好原料，因而超臨界CO2萃取法是一種優異的提取方法，在人參脂溶性成分的工業化提取方面具有巨大的前景。

3 結論

通過單因素和正交實驗對超臨界CO2萃取人參中脂溶性成分工藝進行了優化，得到的最佳工藝參數為:萃取壓力25MPa、萃取溫度40℃、萃取時間3.5h、原料/夾帶劑(g/mL)1∶06，此時人參脂溶性成分的萃取率為85.38% ±3.16%，與前人相關研究文獻相比，本研究的提取率較高。

采用GC-MS對超臨界CO2萃取法萃取的人參的脂溶性成分進行了分析鑒定，共鑒定了28種化合物，以脂肪酸、甾醇類、酯類、倍半萜類以及烯烴類物質為主。萃取的人參脂溶性成分中含有豐富的不飽和脂肪酸，具有較高的營養價值;其含有的植物甾醇、倍半萜類等化合物也是重要的生物活性物質，這些都表明超臨界CO2萃取物具有一定的生物活性。

超臨界CO2萃取法是一種公認的油脂類物質提取較為完全的方法，可實現萃取分離一體化，萃取過程短，提取系統密閉、提取溫度低。此外超臨界CO2萃取法具有收率高、無溶劑污染等優點，人參作為重要的食藥用植物資源，此法對于人參脂溶性成分的工業化生產應用有較好的前景。

［1］Wang Y T，You J Y，Yu Y，et al.Analysis of ginsenosides in Panax ginseng in high pressure microwave-assisted extraction［J］.Food Chemistry，2008，110:161-167.

［2］張崇喜.人參、西洋參和三七化學成分的研究［D］.長春:吉林農業大學，2004.

［3］Wang Y，Jiang R Z，Li G R，et al.Structural and enhanced memory activity studies of extracts from Panax ginseng root［J］.Food Chemistry，2010，119:969-973.

［4］孫艷.人參仿生化提取分離及初步藥效學研究［D］.長春:長春中醫藥大學，2011.

［5］魏愛書，趙銳.人參揮發油的研究進展［J］.人參研究，2010(2):39-41.

［6］秦嬌.毛竹葉揮發油的提取及抑菌作用的研究［D］.北京:北京林業大學，2010.

［7］王世永.吳茱萸揮發油的提取分離、鑒定及抗氧化和抗菌活性研究［D］.武漢:華中農業大學，2008.

［8］Uribe J A R，Perez J I N，Kauil H C，et al.Extraction of oil from chia seeds with supercritical CO2［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2011，56(2):174-178.

［9］周鳴謙，劉云鶴，林春梅.超臨界CO2萃取黑莓籽油及其成分分析［J］.食品科學，2012，33(8):39-42.

［10］韓志慧.山茱萸有效成分的提取及相關基礎研究［D］.鄭州:鄭州大學，2007.

［11］鄧楚津，聶芳紅.超臨界CO2萃取劍麻中總皂苷的工藝研究［J］.科學研究，2008，29(2):41-44.

［12］Sodeifian G，Ansari K.Optimization of Ferulago angulata oil extraction with supercritical carbon dioxide［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2011，57(1):38-43.

［13］程健，申文忠，劉以紅.天然產物超臨界CO2萃取［M］.北京:中國石化出版社，2009:68-75.

［14］李紅茹.超臨界流體在中藥雷公藤制劑中的應用及其溶解度的理論研究［D］.天津:天津大學，2008.

［15］曹立軍，徐濤，趙花，等.超臨界CO2萃取人參揮發油工藝的研究［J］.人參研究，2012(3):8-10.

［16］魏建華，徐濤，曹立軍，等.超臨界CO2萃取人參脂溶性成分的 GC—MS分析［J］.人參研究，2012(4):19-22.

［17］張秀麗，趙巖，沈宏圖，等.人參與西洋參脂溶性成分的GC-MS 分析［J］.特產研究，2011(4):49-53.

［18］Richter R，Basar S，Koch A，et al.Three sesquiterpene hydrocarbonsfrom the rootsofPanax ginseng C.A.Meyer(Araliaceae)［J］.Phytochemistry，2005，66:2708-2713.

［19］楊艷輝，楊興斌，王燕，等.人參脂肪酸和揮發油成分的GC-MS分析［J］.陜西師范大學學報:自然科學版，2007，35(1):77-81.

［20］王恩鵬.人參花揮發油的質譜研究［D］.長春:長春中醫藥大學，2010.