連錢草總黃酮提取工藝優化

1.湖北民族學院生科院，湖北 恩施 445000；2.南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司，江蘇 洪澤 223200；3.南京醫藥股份有限公司博士后工作站，江蘇 南京 210012

連錢草為唇形科活血丹屬植物活血丹[Glechomalongituba(Nakai) Kupr.]干燥地上部分。連錢草性味涼辛，微苦，微寒。歸肝、腎、膀胱經[1]，具有利膽、利尿、抗菌、抗炎、降血糖、抗腫瘤以及抗腹瀉等藥理作用，主治黃疸型肝炎、膽囊炎、膽石癥、疳積、腎結石、膀胱結石、多發性膿瘍、瘡癰腫痛、嬰兒濕疹、跌打損傷、腮腺炎、牙痛等癥[2]。

連錢草的主要化學成分有萜類[3]、黃酮[4,5]、揮發油[6]、有機酸[7,8]以及多糖等。其中，萜類化合物主要包括熊果酸、齊墩果酸、烏蘇酸、2-羥基烏蘇酸等；黃酮和黃酮苷類化合物包括木犀草素、蘆丁、芹菜素、刺槐素、海常素、胡蘿卜苷、槲皮素、連錢草酮等；揮發油類化合物包括左旋薄荷酮、胡薄荷酮、旅烯、檸檬烯、1,8-桉葉素、異薄荷酮、異松樟酮、α-松油醇等，具有特殊的清香味；有機酸類化合物包括阿魏酸、咖啡酸、介子酸、月桂酸、迷迭香酸、原兒茶醛、迷迭香酸甲酯、三十烷酸、肉豆蔻酸等有機酸。

目前針對連錢草總黃酮提取工藝的研究尚不多見。本研究通過考察提取時間、提取溫度、液固比和乙醇等因素，采用單因素試驗和Box-Behnken試驗優化了連錢草總黃酮的提取工藝，結果理想，報告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 TU-1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、RT-02A型多功能粉碎機(弘荃機械企業有限公司)、BECKMAN COUCTER型離心機(美國BECKMAN公司)、HHS型恒溫水浴鍋等儀器(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)。

1.2 試藥 連錢草由南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司提供(經姜寧副教授鑒定為唇形科活血丹屬植物活血丹[Glechomalongituba(Nakai) Kupr.])，烘干，粉碎，過60目篩；無水乙醇、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 黃酮含量的測定 以蘆丁為標準品，參照文獻[9]進行。

2.2 Box-Behnken試驗

2.2.1 Box-Behnken試驗設計 在預試驗基礎上，采用 Design-Expert 8.0的Box-Behnken 設計，以提取時間、溫度、液固比、乙醇濃度為自變量，黃酮提取率為響應值。試驗因素水平設計和結果分別見表1、表2。

表1 因素水平編碼

表2 Box-Behnken試驗結果

根據試驗結果，建立了如下回歸模型：R=6.38-0.16A+0.057B+0.44C+0.11D+0.15AB+0.11AC+0.62AD+0.36BC+0.030BD+0.013CD-0.63A2-0.61B2-0.85C2-0.54D2。該回歸模型的決定系數R2為0.9746，校正后的決定系數(adj-R2)為0.9493，說明該模型擬合性較好。對回歸模型和各因子進行方差分析，結果見表3。從表3可知：該模型F值為38.41，P值<0.0001，而失擬性試驗F值為2.19，不顯著，說明此模型與實際情況擬合得較好。根據F值和P值，可以得出各因素對響應值的作用由大到小為：C2>A2>B2>C>D2>AD>BC>A>D>AB>AC>B>BD>CD。其中：B、AB、AC、BD、CD對響應值的作用不顯著，所以上述回歸方程中以上幾項可以忽略，所得回歸方程如下：R=6.38-0.16A+0.44C+0.11D+0.62AD+0.36BC-0.63A2-0.61B2-0.85C2-0.54D2。

表3 Box-Behnken試驗結果方差分析表

2.2.2 優化工藝的確定 由Box-Behnken試驗結果所得的回歸方程，可以計算出當A=-0.05，B=0.13，C=0.28，D=0.08時，R有極大值6.45%。將各因素的水平回代，可以得到最優工藝是提取時間1.4975h，41.3℃，液固比22.8∶1，乙醇濃度90.4%時，黃酮提取率最高。為了操作方便，將優化的工藝確定為提取時間1.5h，提取溫度41℃，液固比23∶1，乙醇濃度90%，并對該工藝進行了驗證，連錢草黃酮提取率在6.32%～6.47%之間。說明經過響應面法優化的工藝具有很強的實踐指導作用。

2.2.3 響應面分析 圖1為響應面分析。從中可以看出：當C=0.28，D=0.08時，黃酮的提取率隨著A和B的增加而上升，當達到最大值后，A和B的上升反而會使提取率下降(圖1A)；B和D分別為0.13、0.08時，A和C處于低水平時，響應值較低，隨著A和C的升高，響應值也隨之升高，當到一定程度后，響應值不再隨A和C的上升而上升，而是下降(圖1B)；如B=0.13、C=0.28，A和D的變化會顯著影響黃酮的提取率，當A和D較小時，黃酮提取率也較低，當A和D增大后，提取率也增高，當提取率達到極大值后，其會隨著A和D的上升而下降(圖1C)；圖1D顯示了B和C對響應值的影響，響應值開始隨著B和C的上升而上升，當達到一定值后，反而會隨著B和C的上升而下降； 隨著B和D的變化，響應值的變化則較平緩(圖1E)；A=-0.05、B=0.13時，當C和D較小時，提取率也較低，C和D上升后，提取率也增加，當提取率達到最大值后，C和D的增加反而會使提取率下降，不過下降的幅度較上升的幅度平緩(圖1F)。

3 討論

提取時間、提取溫度、液固比和乙醇濃度是影響黃酮提取率的四個主要因素。提取時間的延長會增加植物體內的黃酮溶出，當提取達到一定時間后，連錢草黃酮的提取率不再顯著增加，這是因為浸出液中黃酮與植物內的黃酮濃度差縮小，黃酮溶出速度下降。提取溫度41℃時連錢草黃酮的提取率最高，隨后溫度的提高反而會使提取率下降，說明高溫可能會破壞連錢草黃酮的結構。液固比的增加會提高植物內黃酮與浸出液中黃酮的濃度差，從而加快黃酮的溶出，但當液固比過大時，會使后續處理繁瑣，加大處理過程中的損耗從而使提取率下降。本研究中乙醇濃度較高時，連錢草黃酮的提取率較大，說是連錢草黃酮在高濃度的乙醇溶液中溶解性較好。響應面法是優化黃酮提取工藝常用的方法之一，本研究通過響應面法優化的連錢草黃酮提取工藝得到驗證，有很好的實用性。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京：中國醫藥科技出版社，2010．

[2]宋銳，張云，叢曉東，等．連錢草的化學成分及生物活性研究進展[J]．中華中醫藥學刊，2010，28(12)：2511-2514．

[3]張前軍，楊小生，朱海燕，等．連錢草中三萜類化學成分[J]．中草藥，2006，37(12):1780-1781．

[4]楊念云，段金廒，李萍，等．連錢草中的黃酮類化學成分[J]．中國藥科大學學報，2005，36(3)：210-212．

[5]黃天賜，聶晶，張立群．連錢草中黃酮、有機酸類成分的HPLC指紋圖譜[J]．中國實驗方劑學雜志，2013，19(1)：132-135．

[6]吳麗群，江芳．連錢草揮發油化學成分的研究[J]．中國醫藥科學，2012，2(23)：101-102．

[7]劉杰，李國強，吳霞，等．連錢草的化學成分研究[J]．中國中藥雜志，2014，39(4)：695-698．

[8]于志斌，吳霞，葉蘊華，等．連錢草化學成分研究[J]．天然產物研究與開發，2008，20(2)：262-264．

[9]田春蓮，蔣鳳開．茜草總黃酮提取工藝研究[J]．食品科學，2011，32(24)：60-63．