大豆分離蛋白熱性質及其空間構象對表面疏水性的影響

吳海波 齊寶坤 江連洲 李 楊

馮紅霞1 曹 亮1 馬文君1 丁 儉1 王 瑞1

（東北農業大學食品學院1，哈爾濱 150030）

（東北農業大學國家大豆工程技術研究中心2，哈爾濱 150028）

大豆不僅是優良的油料作物，也是理想的食用蛋白資源。從不同品種中提取的大豆分離蛋白的組成、結構、空間構象及熱性質均不同，對大豆蛋白的營養性、功能特性有很大的影響［1］。蛋白質的功能特性大體上可以分三類：一是蛋白質與水相互作用，二是蛋白質與蛋白質的相互作用，三是蛋白質的表面性質。對于一些已知結構的蛋白質表面性質的分析表明，一些疏水基團也會出現在蛋白質表面，使蛋白質表面也具有一定的疏水性。據有關研究指出蛋白質的大分子結構，表面疏水性是影響分子間相互作用的主要因素［2］。很多研究中得出結論：蛋白質的表面疏水性是影響蛋白質功能性質的最重要的因素。

不同的大豆蛋白組分（7S或11S）具有不同的分子結構，其熱性質和表面疏水性均不同，且大豆蛋白的熱性質與其表面疏水性具有一定的關系。差示量熱掃描法（Differential Scanning Calorimetry，簡稱DSC）是20世紀60年代研究出的一種蛋白質熱力學分析方法，已經廣泛應用于蛋白質熱性質及熱穩定性的研究［3］。熒光光譜法（色氨酸熒光光譜）是在三級結構層面上來解析蛋白質的構象差異，同時分析其空間微環境的變化。

本試驗分別采用DSC法和熒光光譜法對不同品種大豆分離蛋白的熱性質和空間構象進行分析，結合對大豆分離蛋白表面疏水性測定，探討大豆蛋白的熱性質和空間構象對其表面疏水性的影響，進而改善大豆分離蛋白的功能性質，為其在食品中的實際應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆：品種為東農46、黑農46、皖豆24、五星4、冀 NF58、中黃13。

Lowry法蛋白質含量測定試劑盒：上海荔達生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）：美國Sigma公司；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、HCl、NaOH均為分析純。

低溫高速離心機：美國Beckman公司；PHSJ-4A型實驗室pH計：中國上海雷磁公司；722型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；PE Pyris6差示掃描量熱儀：美國PULUSTA.XT公司；F-4500熒光分光光度計：日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆分離蛋白的制備

原料大豆經去皮、粉碎后過60目篩，然后在40℃條件下采用正己烷萃取以制備脫脂豆粕。將脫脂豆粕按1∶15的質量比與水混合，用2 mol／L NaOH調pH值至8.0，攪拌l.5 h后，將其懸浮液在4℃條件下10 000×g離心30 min，取上清液用2mol／L HCl調pH值至4.5。靜置后在4℃條件下6 000×g離心30 min，取蛋白沉淀水洗2次，最后取沉淀分散于水中并用2 mol／L NaOH調pH值至7.0。再在4℃條件下10 000×g離心30 min，除去少量的不溶物，將其蛋白溶液冷凍干燥后粉碎即得粉末狀大豆分離蛋白。蛋白質含量的測定依據GB／T 5009.5—2010。

1.2.2 蛋白質表面疏水性的測定

參考Kato等［4］的方法。采用ANS熒光探針法。分別稱取0.025 g不同品種蛋白樣品溶于50 mL磷酸鹽緩沖液（0.01 mol／L，pH7.0）中，在室溫條件下攪拌1.0 h，然后在10 000×g離心30 min，取上清液用Lowry法測定蛋白濃度，并用同一磷酸鹽緩沖液依次稀釋（濃度0.005～0.5 mol／mL）后，取不同濃度樣品的溶液4 mL，分別加入40μL濃度為8 mmol／L的ANS溶液（用0.01 mol／L，pH7.0的磷酸鹽緩沖液配制），經振蕩后靜置3 min，再測定樣品的熒光強度（FI）。試驗中激發波長λex＝370 nm，發射波長λem＝490 nm，夾縫為5 nm。以熒光強度對蛋白質濃度作圖，初始段斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數（So）。

1.2.3 蛋白質熱性質的測定

依據Tang等［5］的方法。利用PE Pyris 6-DSC熱力分析儀測定大豆分離蛋白樣品的熱力學特性。稱取5 mg的樣品放入鋁盒中，再向其中加入10μL的0.01mol／L的磷酸緩沖溶液（pH 7.0），壓盤密封，室溫條件下放置6 h；將平衡好的樣品鋁盒放入到DPS操作臺左側，空白鋁盒放置在右側。溫度掃描范圍：20～120℃；升溫速率：10℃／min；在120℃保持1 min；隨后從120℃降溫至20℃，降溫速率：30℃／min。記錄此過程中大豆分離蛋白的變性溫度（T d）和變性焓變（ΔH）。所有的試驗結果為3次測定值的平均值。

1.2.4 蛋白質空間構象的分析

參考尹壽偉［6］的方法。采用F-4500熒光分光光度計測定大豆分離蛋白的內源性熒光光譜（色氨酸熒光光譜）。將大豆分離蛋白樣品分別分散于0.01 mol／L磷酸緩沖液（pH 7.0）中，配制蛋白質量濃度為0.15 mg／mL。熒光發散光譜分析以蛋白質分子內部的色氨酸熒光基團為探針，為了降低酪氨酸的貢獻，熒光光譜激發波長為290 nm，發散光譜掃描范圍為300～400 nm，激發狹縫和發射狹縫寬均為5 nm。

1.2.5 統計分析

每個試驗重復3次，結果表示為平均數x±s。數據統計分析采用SPSS V17.0軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異，采用Origin8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 大豆蛋白含量

由表1可知，采用不同品種的大豆所提取分離蛋白的蛋白質量分數均高于90%，純度較高，可用于本試驗中蛋白質組成和性質的測定。

表1 不同品種大豆分離蛋白的蛋白含量（x±s，n＝3）

2.2 不同品種大豆分離蛋白的表面疏水性

圖1為不同品種大豆分離蛋白的表面疏水性。由圖1可以看出，6種大豆分離蛋白的表面疏水性也存在顯著性差異（P＜0.05），表面疏水性數值在650.44%與793.16%之間，且從大到小順序依次為：793.45（東農46號）＞780.44（皖豆24號）＞767.71（黑農46號）＞675.64（五星4號）＞663.57（中黃13號）＞650.43（冀NF58）。這表明不同品種大豆分離蛋白的表面疏水性不同，可能由于不同蛋白質的分子結構、構象及其熱性質不同，導致其表面疏水性的差異［7］。

圖1 不同品種大豆分離蛋白的表面疏水性

2.3 大豆分離蛋白熱性質對表面疏水性的影響

蛋白質的熱力學分析就是通過測量蛋白質在連續升溫破壞其高級結構過程中所需的能量變化情況和變性溫度。通過計算示差掃描量熱儀（DSC）譜圖中最大峰對應的溫度和峰面積可分別確定變性溫度（T d）及變性焓ΔH）。變性溫度反應蛋白質的熱穩定性，而變性焓則反映蛋白質分子的疏水性或親水性，同時也表征蛋白質分子的聚集程度（反映有序結構所占比例）［8］。

6種品種的大豆分離蛋白的熱力學分析結果見表2。由表2可知，6個品種大豆分離蛋白中7S球蛋白和11S球蛋白的ΔH值和Td值之間存在顯著性差異；6種品種大豆分離蛋白中11S球蛋白的Td值和ΔH值均高于7S球蛋白，也說明11S球蛋白的熱穩定性高于7S球蛋白。6種分離蛋白中7S球蛋白的Td值在74.2～78.1℃之間，11S球蛋白的Td值介于85.0～93.3℃之間，結合不同品種分離蛋白的表面疏水值對其分析，發現7S球蛋白與11S球蛋白的Td值與表面疏水性存在顯著的負相關，相關系數分別為 -0.923（P＜0.01）和 -0.893（P＜0.05），說明大豆蛋白的熱穩定性越好，其表面疏水性越小；7S球蛋白的ΔH值在22.41～51.26 J·g-1之間，差異幅度較大，以冀NF58最高，中黃13號次之，東農46號最低；11S球蛋白的ΔH值在35.68～67.53 J·g-1之間，其中中黃13號和冀NF58的ΔH值相對較高，東農46號和皖豆24號的ΔH值較低，通過相關性分析得知，不同品種的大豆分離蛋白的7S球蛋白與11S球蛋白的ΔH值與表面疏水性也存在顯著負相關，相關系數分別為 -0.874（P＜0.05）和 -0.876（P＜0.05），即7S球蛋白與11S球蛋白的ΔH值越小，表面疏水性越大。分析原因是ΔH值越低，反映蛋白質的有序結構所占比例越低，分子相對伸展，分子內部的疏水性殘基暴露較多，導致蛋白質具有相對較大的表面疏水性。

表2 6種分離蛋白的熱力學分析

2.4 大豆分離蛋白空間構象對表面疏水性的影響

基于前面對大豆分離蛋白熱穩定性和表面疏水性研究的基礎上，采用內部熒光光譜（色氨酸熒光光譜）在三級結構層面上來解析6種蛋白的構象差異。6種大豆分離蛋白的內部熒光光譜如圖2所示。本研究采用290 nm作為激發波長，所得圖譜主要是色氨酸（Try）為發射基團的熒光光譜，表征色氨酸微環境極性的變化，是一種在三級結構水平反映蛋白質構象變化的比較靈敏的技術手段。熒光峰紅移表明熒光發射基團（Try）更加暴露于溶劑，也就是熒光發射基團的微環境極性增加，藍移則表明發射基團（Try）位于更為疏水的微環境中，而熒光峰強度下降與熒光猝滅相關聯的（猝滅劑存在于溶劑或蛋白質分子內部）［9］。圖2所示，6種大豆分離蛋白具有典型的色氨酸發射光譜，6種分離蛋白的熒光峰分布在335.8～339 nm之間，依次為339 nm（東農46號）＞338.4 nm（皖豆24號）＞337.6 nm（黑農46號）＞337.2 nm（五星4號）＞336.6 nm（中黃13號）＞335.8 nm（冀NF58），熒光峰峰位之間存在顯著性差異（P＜0.05），并且不同品種的大豆分離蛋白隨著熒光峰峰位數值和峰強越大，所具有的表面疏水性越高。分析原因可能是由于6種大豆分離蛋白的色氨酸光譜熒光峰均大于330 nm，色氨酸殘基部分暴露于親水區［10］，熒光峰峰位數值越大（發生紅移），峰強越高，色氨酸殘基的微環境極性越強，埋藏在內部的疏水基團的暴露是導致表面疏水性增大的主要原因［11-13］，這與大豆品種密切相關。

圖2 6種大豆分離蛋白的熒光光譜圖

3 結論

采用差示量熱掃描（DSC）法和熒光光譜法對不同品種大豆分離蛋白的熱性質和空間構象進行分析，結合對大豆分離蛋白表面疏水性測定，探討大豆蛋白的熱性質和空間構象對其表面疏水性的影響。通過差示量熱掃描發現不同品種的大豆分離蛋白的7S球蛋白與11S球蛋白的Td值、ΔH值與表面疏水性存在顯著負相關，即7S球蛋白與11S球蛋白的T d值、ΔH值越小，表面疏水性越大。分析原因是ΔH值越低，反映蛋白質的有序結構所占比例越低，分子相對伸展，分子內部的疏水性殘基暴露較多，導致蛋白質具有相對較大的表面疏水性。熒光光譜表明6種大豆分離蛋白具有典型的色氨酸發射光譜，熒光峰峰位之間存在顯著性差異，并且不同品種的大豆分離蛋白隨著熒光峰峰位數值和峰強越大，色氨酸殘基的微環境極性越強，表面疏水性越高。這與大豆品種密切相關，埋藏在內部的疏水基團的暴露是導致表面疏水性增大的主要原因。

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