柱前衍生化法農(nóng)產(chǎn)品中γ-氨基丁酸的檢測(cè)方法研究

劉鐵兵 龔金炎，2 朱銀邦 李博斌，2 趙 振 郭小青 黃 俊

（浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院1，杭州 310023）

（紹興市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)院博士后工作站2，紹興 312071）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），廣泛存在于自然界，由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化而來，是哺乳動(dòng)物、甲殼類動(dòng)物和昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［1］，具有鎮(zhèn)定神經(jīng)，抗焦慮、解毒等功效［2-5］。

關(guān)于γ-氨基丁酸的檢測(cè)近年來國(guó)內(nèi)外已有氨基酸分析儀測(cè)定、色質(zhì)聯(lián)用法、柱層析熒光測(cè)定法、高效液相色譜法等報(bào)道［6-12］，柱前衍生化法鮮見報(bào)道。

本試驗(yàn)采用丹磺酰氯作為衍生劑，建立了一種快速測(cè)定以糙米、活性紅豆、活性綠豆、活性谷胚芽等的農(nóng)產(chǎn)品中γ-氨基丁酸含量的柱前衍生化高效液相色譜方法。成功的分析了其中γ-氨基丁酸的含量，在精密度、穩(wěn)定性、靈敏度等方面取得了較好的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與試劑

LC-20A液相色譜儀（Prominence SPD-20A／20AV UV-VIS檢測(cè)器）：日本島津公司；色譜柱：Hypersil ODS2 C18（5μm ×4.6 mm×250 mm）：大連依利特；溶劑抽濾裝置：天津市琛航科技儀器有限公司：PHS-3C型酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠；甲醇（色譜純）、γ-氨基丁酸（純度＞99%）、丹磺酰氯（純度＞99%）：天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；活性谷胚芽粉、活性紅豆、糙米、活性綠豆等：寧波天禾堂生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pH值和衍生化時(shí)間的確定

0.1mol／L的醋酸鈉溶液調(diào)pH分別為6.0、7.0，0.1 mol／L的碳酸氫鈉溶液調(diào) pH分別為7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，將上述7種溶液分別配成含1.0 mmol／L的γ-氨基丁酸溶液，然后各取0.2 mL，再加入等量的丹磺酰氯丙酮（4.0 g／L）溶液，避光，置于55℃水浴中衍生1 h。結(jié)果表明，當(dāng)pH≥7.5時(shí)，樣品中的γ-氨基丁酸與丹磺酰氯全部結(jié)合，色譜峰面積穩(wěn)定。由于樣品水提取物存在的酸度不同，當(dāng)提取物被0.1 mol／L碳酸氫鈉溶液稀釋時(shí)，稀釋后的樣品pH只要大于7.5，則該方法具有良好的重現(xiàn)性。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 碳酸氫鈉溶液：稱取碳酸氫鈉8.4 g溶于900 mL水中，用1 mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH至9.5，加水至1 L，配成0.1 mol／L溶液。

1.2.2.2 衍生試劑丹磺酰氯溶液：稱取丹磺酰氯0.04 g，加丙酮稀釋至10 mL，搖勻，配成4 g／L的溶液，置于4℃冰箱中密封避光保存。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液：稱取γ-氨基丁酸標(biāo)樣0.01 g，用上述碳酸氫鈉溶液定容至10 mL，配成1 mg／mL的母液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和丹磺酰氯溶液各0.2 mL置于1 mL棕色容量瓶中，搖勻，于55℃水浴中避光進(jìn)行衍生化，1 h取出，冷卻至常溫后，用甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45μm微孔濾膜。

1.2.4 色譜條件

泵：四元梯度泵；色譜柱：ODSHYPER-SIL C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm）；流速：1.0 mL／min；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A，甲醇（50%）；B，水（50%）；進(jìn)樣量：5μL。

1.2.4.1 波長(zhǎng)的選擇：對(duì)γ-氨基丁酸與丹磺酰氯衍生物在190～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，γ-氨基丁酸在254 nm波長(zhǎng)處有主要吸收峰，故選取254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.4.2 梯度洗脫程序：用1.0 g／L標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物按圖1梯度洗脫程序進(jìn)行探索，找出最佳流動(dòng)相比例。

圖1 梯度洗脫程序圖

根據(jù)梯度洗脫程序進(jìn)行試驗(yàn)得出的結(jié)果表明，γ-氨基丁酸衍生物在流動(dòng)相配比為A∶B＝50∶50時(shí)出峰效果較好，故梯度洗脫程序?yàn)閳D2；色譜圖見圖3。

圖2 梯度洗脫程序圖

圖3 1 mg／mLγ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)液衍生物色譜圖

1.2.5 線性關(guān)系：取1 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液分別稀釋成0.50、0.25、0.20、0.10、0.05 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成6個(gè)濃度梯度考察線性關(guān)系，各濃度標(biāo)樣衍生后用0.45μm微孔濾膜過濾。每個(gè)濃度的標(biāo)樣分別做3次平行試驗(yàn)，得到的峰面積取平均值，獲得峰面積（X）對(duì)質(zhì)量濃度（Y，mg／mL）的線性回歸曲線。

1.2.6 精密度：用上述檢測(cè)方法平行測(cè)定同一標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.40 mg／mL）衍生物樣品6次。

1.2.7 重復(fù)性：用上述建立的檢測(cè)方法平行測(cè)定活性紅豆樣品6次。

1.2.8 穩(wěn)定性：取同一標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物樣品（1.00 mg／mL），放置于4℃的冰箱中避光保存，分別保存0、1、3、7 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平均測(cè)定3次。

1.2.9 回收率：取0.50 mL 1.00 mg／mL標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到0.50 mL活性紅豆、活性綠豆、糙米、活性谷胚芽樣品中，采用相同處理方法和HPLC條件進(jìn)行3次平行測(cè)定。

1.2.10 檢測(cè)限：選取3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度0.05、0.10、0.20 mg／mL，每一個(gè)濃度水平上分別重復(fù)測(cè)定，將檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行線性回歸。

1.2.11 樣品預(yù)處理方法

分別取糙米、活性紅豆、活性綠豆、活性谷胚芽樣品，經(jīng)分別粉碎后，準(zhǔn)確稱取各樣品10.0 g，用碳酸氫鈉溶液定容至100 m L，浸提1 h，取10 mL于5 000 r／min離心40 min，取上清液和丹磺酰氯溶液各0.2 mL置于1 mL棕色容量瓶中，搖勻，于55℃水浴中避光進(jìn)行衍生化，1 h取出，冷卻至常溫后，用甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45μm微孔濾膜。

2 結(jié)果與分析

2.1 保留時(shí)間

根據(jù)以上色譜條件，用1.00 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物和空白樣進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，γ-氨基丁酸衍生物的保留時(shí)間為6.454 min，色譜圖見圖3、圖4。

圖4 空白樣色譜圖

2.2 線性關(guān)系

濃度和峰面積的線性關(guān)系為Y＝1.7E-7X-0.001 97，R2＝0.999 9（標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖5），由于衍生過程中標(biāo)樣被稀釋5倍，故該線性方程表明γ-氨基丁酸濃度在0.01～0.2 mg／mL時(shí)具有良好的線性關(guān)系。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 精密度

試驗(yàn)得到的峰面積值依次為2 500 874、2 503 758、2 511 250、2 507 524、2 505 683、2 502 675平均值為2 505 294，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.15%。

2.4 重復(fù)性

樣品中γ氨基丁酸的含量依次為270.2、263.6、269.8、268.7、270.5、264.0μg／g，平均值為 267.8 μg／g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%。

2.5 穩(wěn)定性

測(cè)得的γ-氨基丁酸衍生物峰面積平均值依次為 5 983 529、5 982 715、5 980 866、5 979 673，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.03%，表明樣品在4℃避光保存一周內(nèi)是比較穩(wěn)定的。

2.6 加標(biāo)回收

由表1可知平均回收率99.67%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.17%，符合定量分析的要求。

試驗(yàn)得出每個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)偏差S1＝0．000 505 106、S2＝0．000 244 92、S3＝0．002 513 26。用線性回歸法作出回歸線y＝0．014 7x-0．000 6，然后把回歸線延長(zhǎng)，外推至與縱坐標(biāo)相交，求得S0＝0．000 6，定義3 S0為方法的檢測(cè)下限，即為0.001 8 mg／mL。

表1 活性紅豆、活性綠豆、糙米、谷胚芽加標(biāo)回收率／%

2.7 農(nóng)產(chǎn)品中GABA含量測(cè)定

按照上述的檢測(cè)方法，測(cè)得的活性紅豆樣品的HPLC圖譜見圖6；測(cè)得的活性綠豆樣品的HPLC圖譜見圖7；測(cè)得的糙米樣品的HPLC圖譜見圖8；測(cè)得的活性谷胚芽樣品的HPLC圖譜見圖9。由圖可見保留時(shí)間6.0～6.4 min之間有1明顯的峰，即為γ-氨基丁酸衍生物的峰。

圖6 活性紅豆樣品HPLC圖譜

圖7 活性綠豆樣品HPLC圖譜

根據(jù)上述方法，對(duì)活性紅豆、活性綠豆、糙米和谷胚芽粉進(jìn)行處理衍生后過0.45μm微孔濾膜。按照上文建立的檢測(cè)方法平行測(cè)定3次，所得的農(nóng)產(chǎn)品中含的γ-氨基丁酸含量見表4。該方法回收率在95%以上，4種產(chǎn)品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.86%、1.35%、1.41%、1.06%，測(cè)定結(jié)果可靠。

圖8 糙米樣品HPLC圖譜

圖9 谷胚芽樣品HPLC圖譜

表2 農(nóng)產(chǎn)品樣品中γ-氨基丁酸含量

由表2可見，活性紅豆、活性綠豆、糙米和谷胚芽中γ-氨基丁酸的含量都在200～300μg／g之間，其中活性紅豆最高，適合用于富集GABA。

3 結(jié)論

研究建立了丹磺酰氯柱前衍生化法測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中γ-氨基丁酸含量的高效液相色譜方法。經(jīng)過優(yōu)化后的色譜條件為：Hypersil ODS2 C18，流動(dòng)相A為甲醇，B為水（A∶B＝1∶1，pH＝9.5，梯度洗脫），檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30℃，流速為1mL／min，進(jìn)樣量為5μL。該方法高效快速，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)限低，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。用標(biāo)準(zhǔn)樣品考察其線性關(guān)系，所得線性方程為 Y＝1.7E-7X-0.001 97，R2＝0.999 9，表明γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度在0.01～0.2 mg／mL時(shí)具有良好的線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.15%、1.12%、0.03%，表明該方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性都較好。加標(biāo)回收試驗(yàn)所測(cè)得的平均回收率為99.67%，表明用該方法所測(cè)得的結(jié)果可信度較高，可作為GABA含量的定量分析方法。實(shí)際樣品檢測(cè)效果良好。

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