Box-Behnken響應面優化冷榨花生粕酶解制備花生肽工藝

肖懷秋 李玉珍 林親錄 楊 濤 鄧 靖 龔春平

（湖南化工職業技術學院制藥與生物工程系1，株洲 412004）

（中南林業科技大學食品科學與工程學院2，長沙 410004）

（湖南工業大學包裝與材料工程學院3，株洲 412000）

（廣東佛山南海宏仁食品有限公司4，佛山 528000）

花生是我國重要的油料與經濟作物［1］，其加工和綜合利用主要途徑是榨取食用油脂，每年產生花生粕約150多萬t［2］。傳統熱榨法產生的花生粕由于高溫蒸炒和壓榨使蛋白質變性嚴重，有效氨基酸破壞明顯，蛋白質溶解度差，無法直接應用于食品工業，主要用作畜禽或魚類飼料或肥料［3］，而且經高溫熱變性后，蛋白質的營養與生物學價值下降明顯，對精深加工產生了極大的限制。低溫冷榨法由于采取低溫（＜60℃）機械壓榨技術對去紅衣花生仁進行壓榨，在實現花生油和花生蛋白分離的同時，能較好地保持花生粕蛋白的低變性，因而能最大程度地保持花生粕蛋白質的營養價值［3］。在花生粕中含約47%～55%的蛋白質、氨基酸配比合理，且富含人體必需氨基酸［4］，但缺乏相應的精深加工配套技術，造成了花生粕優質蛋白質資源的嚴重浪費［5-6］。因此，加強低溫冷榨花生粕蛋白質的精深加工具有很好社會和經濟意義。

蛋白質經酶促水解產生的小分子蛋白質、多肽及氨基酸，特別是分子多肽比蛋白質營養價值更好，生物吸收利用率比氨基酸更高，可直接為小腸黏膜吸收利用［7］，且蛋白質酶促水解產物具有如抗氧化、抗菌、降血壓、免疫調節、抗血栓形成以及抗菌等多種生物學活性［8-10］。由于酶促水解反應為非線性復雜體系，認識酶解影響因素對酶解過程的作用規律對于控制限制性酶促水解反應和保障產物特異性是極其重要的。響應面優化技術相比傳統正交優化方法更適合于多變量復雜體系的優化分析且可充分考慮因素間交互作用對響應變量的影響，通過構建經驗數值模型并經過回歸分析和方差分析可用于尋找最優參數組合和評價復雜體系中各因素的影響重要性［11］。Box-Behnken設計是最有效的響應面優化方法之一，在酶促水解制備活性多肽方面應用較為廣泛［12］。本試驗在單因素試驗的基礎上，利用響應面優化分析方法以多肽含量為綜合評價指標對冷榨花生粕酶促制備多肽工藝進行了優化分析，以期為冷榨花生粕蛋白質制備花生多肽的精深加工提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

低溫冷榨花生粕：德州宏鑫花生蛋白食品有限公司；中性蛋白酶：北京鴻潤寶順科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗儀器與設備

Labconco冷凍干燥儀：美國Labconco公司；722型可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；pHS-3CpH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；KQ-300DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 冷榨花生粕蛋白質提取工藝

低溫冷榨花生粕→烘干→粉碎→堿溶2次（1 mol／L NaOH調 pH 8.5，料液比 1∶15，50℃，2 h）→離心（4 000 r／min，15 min）→上清液酸沉（3 mol／L檸檬酸調pH 4.5左右，室溫靜置30 min）→離心（4 000 r／min，15 min）→收集蛋白凝塊→醇洗2次→加堿調整pH 6.5→真空冷凍干燥→花生粕蛋白粉

1.3.2 花生粕蛋白粉的酶促水解工藝

準確稱取一定量花生粕蛋白粉于反應器中，根據固液比要求添加適量蒸餾水攪拌至分散均勻，酶促水解前超聲波預處理10 min并于90℃預熱10 min，冷卻至室溫后調整到預設pH值，根據［E］／［S］準確稱取中性蛋白酶添加到酶解反應系統中，緩慢攪拌并維持酶解系統pH恒定。酶解結束后迅速置于沸水浴中滅酶10 min。冷卻至室溫后4 000 r／min離心10 min，收集上清液。

1.3.3 多肽測定

參考白永蓮等［13］報道方法，略有改動。精密移取酶解液1 mL，加入雙縮脲試劑4 mL作為測定管；精密量取7%標準蛋白0.05 mL加0.9%NaCl 0.95 mL，再加4 mL雙縮脲試劑作為標準管；精密移取0.9%NaCl溶液1 mL加雙縮脲試劑4 mL作為空白管，分別于525 nm波長處測定吸光值。多肽含量計算公式：多肽含量 ＝［（A測-A空）／（A標-A空）］×7%×0.05。

1.3.4 酶促水解制備花生粕多肽工藝優化

1.3.4.1 單因素試驗

考察酶解 pH（4.0～10.0）、酶添加量（0.01～0.09 g／mL）、酶解時間（30～420 min）和底物濃度（0.01～0.13 g／mL）4個因素對酶解的影響，以產物中多肽含量為評價指標。

1.3.4.2 Box-Behnken響應面優化

在單因素試驗結果基礎上確定Box-Behnken響應面優化試驗設計中心點。試驗因素及編碼見表1。

表1 試驗因素水平和編碼

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

考察了酶解pH、酶添加量、酶解時間和底物濃度對酶促制備多肽的影響，結果如圖1所示。

圖1 酶解pH、酶添加量、酶解時間和底物濃度對多肽含量的影響

由圖1a可以看出，在pH 4.0～8.0區間內隨著酶解pH的增加，酶解產物中多肽呈遞增趨勢，pH 8.0時酶解產物中多肽含量最高［（0.048±0.001 9）mg／mL］，當pH再增加時酶解產物中多肽含量呈遞減態勢；由圖1b可以看出，在1%～7%g區間內隨著酶添加量的增加，酶解產物中多肽呈遞增趨勢，最佳添加量為0.07 g／mL［（0.043±0.001 3）mg／mL］，隨后呈下降趨勢；由圖1 c可以看出，酶解最佳時間為180 min。在酶解時間為30～180 min區間內，隨著酶解時間延長，酶解液中多肽含量呈上升態勢。酶解時間為180 min時多肽含量達到最高［（0.051±0.001 1）mg／mL］，隨后呈下降趨勢；由圖1d可以看出，底物質量濃度為0.01～0.09 g／mL區間內，多肽含量隨底物濃度的增加而增加，隨后呈下降趨勢，最佳底物濃度為0.09 g／mL［（0.026±0.001 2］mg／mL。

2.2 酶促水解參數的響應面優化

探討了酶解時間X1、酶添加量X2、酶解pH X3和底物濃度X4對多肽制備的影響，結果如表2（含模型預測值）。

表2 酶解參數響應面優化設計與結果（含模型預測值）

2.2.1 響應面模型構建序貫分析

基于方差分析和回歸分析對響應面模型的構建進行序貫分析［2］，結果如表3所示。模型序貫分析發現，一階線性回歸模型顯著性分析為極顯著（P＜0.001），失擬項極顯著（P＝0.003 1＜0.01）。失擬項顯著表明，若用此模型進行結果預測，出現失誤的概率比較大，需用更高階數值模型進行數據擬合［11］；二因素交互關系模型失擬項也極顯著（P＝0.003 3＜0.05），也不適宜對數據進行數值模擬。二階模型顯著性分析為極顯著（P＜0.000 1），R2＝0.949 0，Adj.R2＝0.901 3，失擬項不顯著（P＝0.129 9＞0.05），表明用此二階模型進行數值擬合是合理的，無需再用更高階模型。序貫分析還發現，三階模型顯著性分析不顯著（P＝0.761 6＞0.05），但由于擬合回歸方程相對較為復雜，實際應用并不方便，因此，選擇二階模型對表2數據進行回歸擬合。

表3 響應面模型構建序貫分析

2.2.2 數值模型的擬合與模型回歸分析

表4 回歸模型方差分析表

對表2數據進行回歸擬合可得方程，即y＝0．113 633+0．001 192x1+0．029 767x2-0．008 01x3-0．007 45x4+0．001 325x1x2+0．009 475 x1x3-0．024 48x1x4-0．002 53x2x3+0．011 85x2x4-0．000 63x3x4-0．016 94x12-0．021 2x22+0．001 783x32-0．021 58x42。

模型方差分析（表4）結果表明，回歸模型是極顯著的（P＜0.000 1），模型 R2＝0.949 0，說明該模型能夠解釋94.90%的總變異，僅有5.10%變異無法用該模型解釋。模型確定系數越大表示模型預測值與實測值間擬合越好，該系數必須大于0.80［14］。模型Adj.R2＝0.901 3表明模型是顯著的。失擬項F值為2.85（P＝0.129 9＞0.05），表明失擬項不顯著，用該模型進行多肽制備預測是切實可行的。變異系數（CV）是模型精度和可靠性的重要指標，變異系數數值越小表明模型可靠性越好。本試驗模型變異系數（CV）為9.91%，表明模型是高度可靠的。可靠模型的信躁比（signal to noise ratio，SNR）要求數值要低于4，本模型SNR＝17.793（＞4）表明模型信躁比是合理的。模型各系數項顯著性檢驗如表5所示。

表5 回歸方程系數顯著性檢驗

由表5可以看出，一次項x1影響不顯著（P＞0．05），x2和 x3影響極顯著（P＜0．01），x4影響顯著（P＜0．05）；交互作用項 x1x2，x1x3，x2x3和 x3x4交互作用不顯著（P＞0．05），x1x4影響極顯著（P＜0．01），x2x4影響顯著（P＜0．05）；二次項 x12，x22和x42影響極顯著（P＜0．01），x32影響不顯著（P＞0．05）。

2.2.3 因素交互作用降維分析

響應面分析中若觀察某兩個因素同時對響應值的影響可借助降維分析［15］。等高線圖能直觀反映因素交互作用對響應值的影響，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形則表示交互作用顯著。酶解時間X1和底物濃度X4的交互作用對響應值的影響以及酶添加量X2和底物濃度X4的交互作用對響應值的影響如圖2所示。由圖2也可以看出，X1X4交互作用項影響極顯著，而X2X4交互作用項影響顯著。

圖2 y＝f（X1，X4）和 y＝f（X2，X4）等高線圖

2.2.4 響應面優化模型診斷

殘差分析是借助圖形分析工具并基于模型無法完全解釋變異的基礎上進行的［15］，可用于響應面優化模型的診斷。在模型診斷中開展誤差方差齊性檢驗是非常重要的。如果預測值內部t化殘差呈隨機散點分布（圖3），則殘差方差齊性是合符要求的。此外，殘差正態分布也是檢驗模型準確性的重要工具，如殘差呈正態概率分布，則殘差擬合曲線呈線性態勢（圖4）［16-17］。由圖3和圖4可以看出，模型預測值內部t化殘差呈隨機性分布，且為正態獨立分布。

圖3 預測值內部t化殘差分布圖

模型預測值與實測值若擬合良好，則數據散點分布且沿模型診斷線呈近似直線分布［3］。模型預測值與實測值擬合如圖5所示。由圖5可看出，模型預測值與實測值擬合度較高，試驗誤差較小。微擾曲線（Perturbation plot）可在響應優化曲面特定區域比較各自變量對響應值的影響［11］，如曲線陡直，表明響應值對因素敏感，如曲線平緩，則表明響應值對因素變化不敏感。由圖6可看出，因素B（酶添加量，X2）對響應值最敏感，因素C（酶解pH，X3）對響應值較為敏感，而A（酶解時間，X1）和 D（底物濃度，X4）對響應值變化不敏感。因此，因素B為最重要因素，其影響為正影響［11］。

圖4 內部t化殘差正態分曲線

圖5 模型預測值vs實測值

圖6 微擾曲線

2.2.5 模型求解與驗證試驗

將回歸方程分別對各自變量求偏導數并令其等于0可得到四元一次方程組，解逆矩陣，得到方程組解為 x1＝0．60，x2＝0．56，x3＝0．98和 x4＝-0.37。經轉換可得到因素實際水平為酶解時間198 min，酶添加量0.081 2 g／mL，酶解 pH 9.96和底物濃度0.082 6 g／mL。為實際操作方便，將優化方案修約為酶解時間200 min，酶添加量0.081 g／mL，pH 10.0和底物質量濃度0.083 g／mL。優化條件下驗證試驗結果為（0.135 6±0.001 4）%（n＝6），與模型預測值0.137 7%接近，偏差為1.55%。

3 討論與結論

酶促水解前對底物進行超聲波預處理可利用超聲波空化作用與機械作用斷裂蛋白質化學鍵，改善酶解微環境并提升酶解效率，同時還可改善酶解產物的功能特性［18］。酶促水解前的熱預處理也可以破壞維持蛋白質三級結構的氫鍵、范德華力等作用鍵，有利于蛋白質的酶促水解。蛋白質酶促水解是一個高度復雜的非線性灰色體系，具有高度的產物多樣性與動力學復雜性［8］。為了對酶解過程進行數值分析并研究各因素對響應值的影響可采取響應面優化分析技術。本研究在單因素試驗基礎上運用Box-Behnken響應面優化分析方法對酶促水解制備冷榨花生粕多肽工藝參數進行優化分析并構建了相應的數值模型，同時對模型進行了回歸與方差分析。響應面優化方案為酶解時間200 min，酶添加量0.081 g／mL，酶解pH 10.0和底物質量濃度0.083 g／mL。優化條件下驗證試驗結果為（0.135 6±0.001 4）%，與模型預測值0.137 7%接近，偏差為1.55%。研究表明，單因素試驗與響應面優化聯用可很好應用于冷榨花生粕酶促水解制備活性多肽工藝的優化分析。

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