響應面法優化黑加侖籽油中γ-亞麻酸富集工藝

焦淑清，張萍，張云杰

（佳木斯大學藥學院，黑龍江省生物藥制劑重點實驗室，黑龍江佳木斯154007）

響應面法優化黑加侖籽油中γ-亞麻酸富集工藝

焦淑清，張萍，張云杰

（佳木斯大學藥學院，黑龍江省生物藥制劑重點實驗室，黑龍江佳木斯154007）

采用響應面優化尿素包合法富集黑加侖籽油中γ-亞麻酸的最佳工藝。在單因素試驗基礎上，選擇包合溫度、尿素/混合脂肪酸配比、95%乙醇/尿素配比（m L/g）、包合時間為考察因素，進行四因素三水平的Box-Behnken中心組合設計，采用響應面法分析4個因素對籽油中γ-亞麻酸含量的影響。結果表明，尿素包合法富集黑加侖籽油中γ-亞麻酸的最佳工藝為包合溫度-20℃、尿素/混合脂肪酸配比3.5∶1、95%乙醇/尿素配比2.5∶1（mL/g）、包合時間21 h，在此條件下，包合后籽油中γ-亞麻酸含量平均值為24.27%。

黑加侖籽油；γ-亞麻酸富集；尿素包合法；響應面分析法

黑加侖（Ribes nigrum L，black.currant）是虎耳草科（Saxifragaceae）茶藨子屬（Ribes）一種漿果植物[1]。其果實常被制作成飲料，在黑加侖果中黑加侖籽占5%～8%[2]，在飲料等加工中產生了大量的黑加侖籽，其籽含油15%～20%，黑加侖籽油中γ-亞麻酸（Gamma Linlenic Acid，GLA）含量高達15%左右，是目前含有GLA最高的植物來源[3]。研究發現GLA對人體有多種藥理作用[4]。研究從黑加侖籽油中富集GLA從而獲得高含量的GLA是研究開發GLA制劑的前提。尿素包合法因其諸多優點而廣泛用于各種不飽和脂肪酸的富集[5]。響應面優化法（Response Surface Methodology，RSM）是一種優化考察條件和加工工藝參數的有效方法[6]。利用響應面法優化尿素包合富集亞麻酸的研究已見報道[7-8]，利用此方法優化黑加侖籽油中γ-亞麻酸的富集工藝未見報道。本文采用超臨界CO2萃取法與尿素包合法相結合從黑加侖籽中提取并富集GLA，采用氣相色譜法（Gas-Chromatography，GC）測定GLA的含量，研究尿素包合中各影響因素對富集效果的影響，利用Box-Behnken響應面分析法優化尿素包合富集黑加侖籽油中GLA的工藝條件，為大規模利用黑加侖籽生產高含量GLA奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

超臨界CO2萃取的黑加侖籽油（自制，γ-亞麻酸含量為15.21%）。標準品γ-亞麻酸甲酯（CDDE-U-63-M-100MG）：美國NU-CHEKPREP生產，購于上海安普科學儀器有限公司；高純氮氣（純度≥99.999%）：佳木斯市東城制氧廠；其它試劑均為分析純。氣相色譜儀（型號7890A）：美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 混合脂肪酸的制備

準確稱取超臨界CO2萃取的黑加侖籽油10 g，置于三頸瓶中，加入NaOH（10%）11 mL、乙醇（95%）25mL，密閉、通入N2，在80℃下攪拌回流1.5 h.。旋轉蒸除皂化液中的乙醇。趁熱將除醇皂化液倒入一倍量的水中，用少量石油醚萃取不皂化物。在水層中加一倍量溫水稀釋，攪拌下滴加6mol/LHCl，酸化至pH= 2～3，靜置分層。水層用石油醚萃取3次，合并醚層，再與油層合并，用5%NaCl水洗至中性，用無水硫酸鈉干燥、抽濾，濾液旋轉蒸發回收石油醚，得到混合脂肪酸。

1.2.2 尿素包合富集GLA

尿素和乙醇（95%）按設定比例混合，置于三頸瓶中，在80℃下攪拌回流20min，待尿素全部溶解后滴加所制備的混合脂肪酸，密閉通入N2，在80℃下繼續攪拌回流40min，倒出冷卻后移至一定溫度下包合一定時間。將包合物迅速抽濾，用溫水洗滌濾餅，取濾液加少量稀硫酸破乳，用石油醚萃取3次，除水取有機層，用5%NaCl溶液洗至中性。加無水硫酸鈉干燥、抽濾，濾液旋轉蒸除石油醚，該濾液即為尿素非包合物，其中以GLA為主，即為包合后的黑加侖籽油。

1.2.3 分析方法

標準曲線制備：精密稱取γ-亞麻酸甲酯對照品2.64mg，置于5mL容量瓶中，加正辛烷溶解成2.64mg/mL的對照液，配制濃度范圍0.132mg/mL～0.792mg/mL。在此范圍內線性關系良好，標準曲線方程為Y=727.73X-21.6（R2=1）。

色譜柱HP5（30m×0.25mm×0.25μm）；檢測器：FID；分流比：30∶1；載氣：高純氮氣；色譜柱溫度：200℃（保持2min）210℃（保持5min）250℃（保持5min）；進樣量：1μL。

樣品處理：精密稱取尿素包合前、后黑加侖籽油樣品各60mg，置于10mL離心管中，加入2mL正辛烷溶解，再加5mL 0.4mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，搖勻，室溫保持10min。加蒸餾水，如上層溶液混濁，加幾滴無水乙醇可迅速澄清，取上層澄清液1μL進樣分析，與對照品溶液對照，外標法定量。

1.2.4 響應面法實驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Design Expert8.0.5.0統計軟件，利用響應面法中box-behnken設計原理，以包合溫度（℃）、尿素/混合脂肪酸（質量比）配比、95%乙醇/尿素配比（mL/g）和包合時間（h）為考察因素，每個因素取3個水平，以-1、0、+1編碼，以富集產物中的γ-亞麻酸含量為響應值，進行實驗設計，因素水平表見表1，試驗設計見表2。

表1 響應面因素水平編碼表Table1 Variables and leves in Box-Benhnken CCD

表2 響應面試驗設計及結果Table2 Box-Benhnken CCD matrix and experimental values of γ-linolenic acid content

2 結果與討論

2.1 響應面分析結果

按表1因素及水平表設計的響應面分析方案進行實驗的結果見表2。

表2中，試驗號1～24是析因實驗，實驗號25～29是中心實驗，29個實驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構成的三維頂點；零點為區域的中心點，零點實驗重復5次，用以估計實驗誤差。

2.2 實驗數據分析

實驗數據分析采用Design Expert8.0.5.0軟件進行多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗，得到以γ-亞麻酸含量為目標函數，關于各條件編碼值的二次回歸方程為：Y=+29.43+0.95X1+0.030X2-0.84X3+0.061X4-0.43X1X2+0.84X1X3-0.048X1X4+0.037X2X3-0.40X2X4-0.58X3X4-2.30X12-2.27X22-1.66X32-1.26X42

對該模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸方程方差分析表Table3 Analysis of variance for fitted quadratic regression equation

由表3可知，一次項中X1、X3的偏回歸系數極顯著，說明包合溫度和95%乙醇/尿素的配比對黑加侖籽油的富集有極顯著影響；X1X3項的偏回歸系數達高度顯著水平，X3X4項的偏回歸系數達顯著水平；二次項中X12、X22、X32、X42的偏回歸系數達極顯著水平。

2.3 交互作用分析

各因素及其交互作用對γ-亞麻酸含量的影響見圖1。

從圖1可以分析得出，對于包合溫度（A）、尿素/混合脂肪酸（B）、95%乙醇/尿素（C）、包合時間（D）四因素，γ-亞麻酸的含量均隨各因素值的增大先增大后減小，其中影響幅度A＞C＞B＞D。此外從各圖還可以分析得出包合溫度與95%乙醇/尿素配比、包合時間與95%乙醇/尿素兩兩間交互作用明顯，其余因素間交互作用不明顯。

圖1 各因素及其交互作用對γ-亞麻酸含量的影響Fig.1 The effect of factors and their interacion of γ-linolenic acid content

2.4 工藝條件的確定

為得出最優提取工藝條件，將回歸模型取一階偏導令其等于零，解關于X1、X2、X3、X4的三元一次方程組，變換成真實值可得包合溫度-20℃、尿素/混合脂肪酸（質量比）配比為3.5∶1、95%乙醇/尿素（mL/g）配比為2.5∶1、包合時間為20.9 h，在此條件下GLA的理論值為24.36%。為了實際操作可行，將理論優化包合工藝參數修正為包合溫度-20℃，尿素/混合脂肪酸配比3.5∶1，95%乙醇/尿素配比2.5∶1（mL/g），包合時間21 h。在此條件下平行進行包合實驗3次，實際測得的平均γ-亞麻酸含量為24.27%，與理論預測值相比，其相對誤差約為0.369 4%，說明該方程與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的可靠性。

3 結論

尿素包合富集黑加侖籽油的最佳工藝條件為包合溫度-20℃、尿素/混合脂肪酸配比為3.5：1、95%乙醇/尿素配比為2.5：1（mL/g）、包合時間21 h，在此條件下黑加侖籽油中γ-亞麻酸的含量為24.27%，比包合前（15.21%）提高了59.57%。響應面分析法適用于對超臨界CO2萃取的黑加侖籽油進行尿素包合富集γ-亞麻酸的參數優化，本研究對大規模利用黑加侖籽生產高含量GLA具有一定的指導意義。

[1]趙麗巖,楊忠生,湯建杰.黑加侖栽培技術[J].北方園藝,2005(9): 50-51

[2]肖輝,張月明,冷愛枝,等.黑加侖提取物抑制腫瘤生長及其抑制研究[J].毒理學雜志,2007,21(2):132-134

[3]呂薇,蔣劍春,徐俊明.尿素包合法純化小桐子油多不飽和脂肪酸的工藝[J].化工進展,2011,30(6):1213-1218

[4]王世磊.Design-Expert軟件在響應面優化法中的應用[D].鄭州:鄭州大學,2009:1-17

[5]歐陽輝,余佶,陳功錫,等.超臨界CO2萃取花椒籽油工藝的響應面優化[J].中國油脂,2009,34(10):9-12

[6]許輝,孫蘭萍,張斌,等.超臨界CO2萃取杏仁油的響應面優化[J].中國糧油學報,2008,23(1):93-97

[7]吳彩娥,許克勇,李元瑞,等.尿素包合法富集獼猴桃籽油中α-亞麻酸[J].農業機械學報,2005,36(5):56-60

[8]楊萬正,關奇,藍榮.尿素包合法富集葵花油中亞油酸的研究[J].中國中醫藥信息雜志,2007,14(5):50-52

Optimization ofγ-linolenic Acid Enrichment Technology from Blackcurrant Seeds Oil by Response Surface Methodology

JIAO Shu-qing，ZHANG Ping，ZHANG Yun-jie
（College of Pharmacy，Jiamusi University，Heilongjiang Province Key Laboratory of Biological Medicine Formulation，Jiamusi154007，Heilongjiang，China）

The present study aimed to optimize enrichment ofγ-linolenic acid from blackcurrant seeds oil using urea inclusion method and response surface methodology（RSM）combined with a 4-variable，3-level Box-Behnken central composite design（CCD）on the basis of single factor experiments.Inclusion temperature，ratio of urea-to-fatty acid，ratio of 95% ethanol-to-urea（mL/g）and inclusion time were studied.Results showed that the optimized enrichment conditions are inclusion temperature-20℃，urea-to-fatty acids ratio 3.5∶1，95% ethanol-to-urea ratio2.5∶1（mL/g）and inclusion time21 h，resulted in a average γ-linolenic acids of seeds oil yield of up to24.27%.

blackcurrant seeds oil；γ-linolenic acid enrichment；urea inclusion method；response surface methodology（RSM）

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.08.013

2013-08-28

本研究項目為佳木斯市2011年度重點科研課題（NO.11097）

焦淑清（1960—），女（漢），教授，本科，從事制藥工程教學和科研工作。