葡萄籽粉對高脂膳食大鼠肝臟抗氧化功能影響

宋春梅，杜鵑，李善姬，劉敏

（吉林醫藥學院，吉林 吉林132013）

葡萄籽是葡萄酒廠的下腳料，含有多種營養成分和生物活性物質，具有較高的營養價值和藥用價值[1-2]。目前的研究結果表明，葡萄籽提取物具有抗氧化、清除自由基、抗炎、預防動脈粥樣硬化和心血管疾病的作用[3-6]。對于葡萄籽粉的營養保健作用研究報道較少。本文通過對高脂膳食大鼠肝組織抗氧化能力及肝細胞超微結構的影響，為葡萄籽做為天然保健食品提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 葡萄籽粉制備

吉林市市售葡萄籽，磨成粉，過40目篩。

1.2 動物分組

wistar雄性大鼠，體重190g～210g，由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供，大鼠購回后，適應性飼養一周后進行實驗。將大鼠按體重隨機分為5組：對照組、高脂模型組、低、中和高劑量葡萄籽粉組，每組12只。分籠飼養，每籠5只，每日自然光照，室溫22℃～25℃。

實驗開始后對照組給予基礎飼料，其余各組給予高脂飼料喂養。對照組和高脂組灌胃蒸餾水，低、中和高劑量葡萄籽粉組分別按照標準人劑量20 g/60 kg的1倍、5倍和10倍的葡萄籽粉的量配成不同的濃度進行灌胃，連續灌胃28 d，每周稱體重一次，記錄大鼠的體重，調節葡萄籽粉灌胃劑量。

飼料組成：基礎飼料為玉米粉35%、大豆粉30%、面粉25%、麩皮10%，另加多種維生素和無機鹽。高脂飼料為79%基礎飼料組成，1%膽固醇，10%豬油，10%蛋黃粉。

1.3 儀器和試劑

TD-5A離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；FA1104N電子天平：上海精密科學。Hitachi-7650透射電鏡：日立公司；超薄切片機：徠卡UC7。

SOD和MDA試劑盒：南京建成試劑公司。

1.4SOD活性和MDA含量測定

實驗結束后，大鼠禁食12h，以10%烏拉坦7mL/kg腹腔麻醉后，打開腹腔，取出肝臟，稱重，制備10%肝組織勻漿液，采用試劑盒測定SOD和MDA，測試方法嚴格按照試劑盒內說明書進行。

1.5 10%肝組織勻漿液制備

稱取肝組織塊1 g，放到冰冷生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干稱重。加入冷生理鹽水9 g，電動玻璃勻漿機勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝于EP管中，冰箱保存。

1.6 肝臟電鏡標本制備

各組隨機取大鼠4只，將大鼠麻醉，固定在解剖臺上，開腹暴露肝臟，取同一部位肝組織，用冰生理鹽水漂洗，將其切成1×1×1 mm3組織塊，置于4℃2.5%戊二醛4%多聚甲醛固定液中，1%鋨酸后固定，梯度丙酮脫水，Epon812包埋，徠卡UC7超薄切片機切片，透射電子顯微鏡Hitachi-7650進行觀察照相。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 葡萄籽粉對大鼠體質量、肝質量和肝系數的影響

葡萄籽粉對大鼠體質量、肝質量和肝系數的影響見表1。

表1 葡萄籽粉對大鼠體重、肝重和肝系數的影響（n=12，±s）Table 1 The effects of grape seed powder on body weight，liver weight and liver index in male rats

表1 葡萄籽粉對大鼠體重、肝重和肝系數的影響（n=12，±s）Table 1 The effects of grape seed powder on body weight，liver weight and liver index in male rats

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由表1可知，大鼠喂養4周后體質量均有明顯增加，各組大鼠體重均增高，但各組間大鼠體重比較，均無統計學差異（p＞0.05）。高脂模型組肝臟重量和肝指數均高于對照組和葡萄籽粉組，各組間相互比較，均無顯著性差異（p＞0.05）。

2.2 葡萄籽粉對大鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響

葡萄籽粉對大鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響見表2。

表2 葡萄籽粉對大鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響（n=8，±s）Table 2 The effects of grape seed powder on the activity of SOD and the contents of MDA in liver tissues of rats

表2 葡萄籽粉對大鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響（n=8，±s）Table 2 The effects of grape seed powder on the activity of SOD and the contents of MDA in liver tissues of rats

注：與對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與高脂模型組比較，#p＜0.05，##p＜0.01。

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表2結果表明，高脂模型組和葡萄籽粉各組大鼠SOD活性均高于對照組，與對照組比較均有顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）；高脂模型組與葡萄籽粉各劑量組比較，葡萄籽粉中和高劑量組有顯著差異（P＜0.05）。MDA含量高脂模型組最高，與對照組和葡萄籽粉各組比較，均有顯著差異（P＜0.01）。

2.3 葡萄籽粉對高脂膳食大鼠肝細胞超微結構的影響

正常對照組：肝細胞呈多邊形，核1個～2個，呈圓形，核仁明顯，核內常染色質多，胞質內可見豐富的粗面內質網、線粒體和糖原顆粒，線粒體嵴清晰，可見少量的溶酶體顆粒。肝細胞膽小管可見，其腔面有微絨毛，小管兩端的緊密連接清晰，肝細胞的肝血竇面有微絨毛，小管兩端的緊密連接清晰，血竇內皮細胞呈扁平形，核扁橢圓形，核內異染色質多（見圖1～圖2）。

圖1 對照組肝臟電鏡結構×1000Fig.1 Electron microscopic structure of liver tissue of control group×1000

圖2 對照組肝臟電鏡結構×2000Fig.2 Electron microscopic structure of liver tissue of control group×2000

高脂模型組：肝細胞體積變小，細胞的界限不清，核呈圓形，1個～2個，核內異染色質略增多，呈塊狀，核基質輕度空化，胞質基質致密，粗面內質網排列緊密，膜增厚，線粒體呈致密狀，嵴不易分清，可見大小不一的圓形脂滴和少量吞噬體。膽小管兩端的緊密連接不易分辨，腔面有微絨毛數量增多，結構不清晰，肝細胞血竇面微絨毛結構消失，呈絮狀（見圖3～圖4）。

圖3 高脂模型組肝臟電鏡結構×700Fig.3 Electron microscopic structure of liver tissue of high lipid group×700

圖4 高脂模型組肝臟電鏡結構×2000Fig.4 Electron microscopic structure of liver tissue of high lipid group×2000

葡萄籽粉組：肝細胞排列緊密，細胞界限隱約可見，肝細胞核圓形，可見雙核，部分肝細胞的核基質呈輕度致密狀，胞質內粗面內質網成堆分布，排列緊密；線粒體較多，呈小圓形，嵴呈致密狀。可見散在分布的糖原顆粒；胞質內脂滴數量較高脂模型組略減少，部分肝細胞胞質基質呈致密狀。膽小管數量較多，腔面微絨毛多。肝細胞超微結構變化較模型組高脂模型組輕（見圖 5～圖 6）。

圖5 葡萄籽粉組肝臟電鏡結構×700Fig.5 Electron microscopic structure of liver tissue of grape seed powder group×700

圖6 葡萄籽粉組肝臟電鏡結構×2000Fig.6 Electron microscopic structure of liver tissue of grape seed powder group×2000

3 討論

在正常生理情況下，機體內源性自由基不斷的產生，產生的自由基可通過體內酶促防御系統如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等清除，使機體內的自由基保持在低濃度的動態平衡中，通常不會對機體造成損傷。一旦氧自由基產生過多或抗氧化體系出現故障，體內氧自由基代謝就會出現失衡，這就會引發脂質過氧化。脂質過氧化是活性氧自由基損傷機體的重要途徑之一。大量研究[7]已顯示，高脂膳食能夠使血脂水平升高，脂代謝紊亂，生物體氧化反應增強，導致體內氧化-抗氧化狀態失衡，發生氧化損傷。MDA是脂質過氧化的產物，機體內MDA的水平間接說明了細胞和組織受損傷的程度。SOD能有效的清除超氧陰離子自由基，代表了機體的抗氧化能力。本研究結果表明，中和高劑量葡萄籽粉組SOD活性高于高脂模型組，葡萄籽粉各組MDA含量顯著下降。這表明葡萄籽粉可通過提高酶類抗氧化物質來調節氧化應激水平。

高脂飲食導制肝臟脂類代謝異常，產生胰島素抵抗，使胰島素抑制脂肪分解的作用降低，促使脂肪分解加強，游離脂肪酸（FFA）增多，升高的脂肪酸可使肝細胞線粒體通透性加大并引起腫脹，肝細胞發生變性、炎細胞浸潤、甚至壞死等。同時也可以引起自由基增多，增多的自由基與生物膜的多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應而引起膜結構的改變。研究表明，高脂膳食肝細胞的超微結構變化：肝細胞基質稀疏，高度脂質化，充斥著大量脂肪空泡，線粒體和粗面內質網等細胞器結構紊亂，數目明顯減少，線粒體嵴大部分融合、消失，核染色質凝集[8-9]。本研究證實，高脂膳食大鼠肝細胞也有相似的結構變化，補充葡萄籽粉可使肝細胞超微結構損傷減輕。主要是葡萄籽具有降低血脂水平，改善脂代謝紊亂，提高SOD活性，降低MDA含量，保護肝細胞結構。

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