發酵促進劑對三孢布拉氏霉菌發酵的影響

李曄，何山，金麗華，蘭蓉，陳思

（1.北京電子科技職業學院生物技術系，北京100029；2.北京化工大學生命科學與技術學院，北京100029）

β-胡蘿卜素是500多種類胡蘿卜素的一種，是橘黃色脂溶性化合物，它是一種重要的食用天然色素和營養強化劑。它不僅是VA原，具有預防眼疾、保護視力的功能，而且還具有抑制細胞變異，抗癌、防癌、抗氧自由基、增強機體的免疫力，維護人體上皮組織的正常生理功能，以及促進兒童生長發育，美容等一系列重要作用[1-5]，在世界的許多國家被廣泛用作食品營養強化劑及添加劑。

至目前為止，已報導的β-胡蘿卜素生產方法有天然提取法、化學合成法和發酵法三種。天然提取法以天然植物為原料，經有機溶劑提取或超臨界萃取制取β-胡蘿卜素，但由于原料含量太低，生產成本高居不下[6]；化學合成法可以使生產成本大幅度較低，但β-胡蘿卜素復雜的結構較難用化學方法合成[7]，而且人們對化學合成品毒副作用的擔心及對天然品的日益崇尚，限制了其市場的發展；利用發酵法生產β-胡蘿卜素成為當前研究的前沿和熱點[8]。三孢布拉氏霉菌（B.trispora）是世界上最常用的β-胡蘿卜素高產菌[9-10]，在培養過程中不需要光照，生物量大。通過天然微生物發酵途徑能生產β-胡蘿卜素，但仍不能滿足市場的需要。因此，需要進一步對B.trispora發酵生產β-胡蘿卜素的條件進行優化，以進一步提高其產量，逐步縮小市場供應與人們需求之間的矛盾。通過我們的初步研究發現：改變培養B.trispora的條件，如添加不同種類的物質可以改善β-胡蘿卜素的產量。因此，本文以β-胡蘿卜素的發酵產量作為監測的主要指標，菌體的干重為參考指標，重點考察了在發酵培養基中添加不同種類及含量的表面活性劑，植物油，無機氮源，有機碳源等發酵生產β-胡蘿卜素的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

三孢布拉氏霉菌（B.trispora），ATCC14271（+）和ATCC14272（-），本研究室提供。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 平板培養基

土豆浸提汁1L，葡萄糖20g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂 15 g，VB1微量。

1.1.2.2 種子培養基

去離子水1L，淀粉40 g，葡萄糖25 g，玉米漿70 g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.1g，VB10.01g，去離子水1 L，pH6.5。

1.1.2.3 基本發酵培養基

淀粉40 g，大豆餅粉 40 g，玉米漿 60 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，VB10.01 g，去離子水 1 L，大豆精油（含有 1 g/100 mL BHT）5 mL，pH6.5。

1.2 方法

1.2.1 平板培養

接種后的平板置于29℃的恒溫培養箱中培養24 h，生長4 d后取出放于室溫下培養2 d，等待孢子生長。

1.2.2 種子培養

在無菌條件下，從已培養4 d的（+）/（-）平板培養基上分別挑取兩環孢子接入500 mL三角瓶（裝液量100 mL）的種子培養中。在28.5℃、180 r/min的條件下培養40 h。

1.2.3 搖瓶發酵培養

在無菌條件下，將正負菌以1∶4比例混合均勻，按照接種量20%接入500 mL三角瓶（裝液量100 mL）的發酵培養基中。在28.5℃、220 r/min的條件下，培養120 h，代謝產物為β-胡蘿卜素。

1.2.4 細胞干重測定

將發酵結束后的濕菌體用紗布過濾，在45℃條件下真空干燥，恒重后稱量得到菌體干重（DCW），即生物量。

1.2.5 β-胡蘿卜素含量的測定

由于番茄紅素的測定較為復雜，而β-胡蘿卜素作為其前體物其含量可以指示出番茄紅素的含量。因此通過測定β-胡蘿卜素的含量來進行說明。由于β-胡蘿卜素為胞內產物，需要將菌體碾磨以便提取β-胡蘿卜素。實驗取0.08 g發酵所得干菌體，添加適量抗氧化劑BHT研磨后用石油醚萃取，過濾后定容于25 mL棕色容量瓶中。

1.2.6 高效液相色譜法

HPLC 分離柱為 Diamonsil C18，5 μm，250 mm ×416 mm；流動相為乙腈與二氯甲烷，體積比為75∶25；檢測波長450 nm；柱溫28℃；流速1.5 mL/min。

2 結果

2.1 大豆精油對發酵的影響

根據國內外的一些研究報道，在B.trispora發酵生產β-胡蘿卜素過程中，添加植物油有利于β-胡蘿卜素的合成。植物油中含有大量的不飽和脂肪酸，在發酵培養基中添加脂肪酸有利于β-胡蘿卜素的合成，其中不飽和脂肪酸比飽和脂肪酸影響大。在B.trispora發酵培養基中添加植物油，不僅可以提供菌體需要的能量與碳源，而且還為β-胡蘿卜素的合成提供雙鍵。因為不同植物油中含有的不飽和脂肪酸的成分和比例不同，本研究中我們選用大豆精油和棉籽粗油進行實驗。在發酵基本培養基的基礎上分別添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%（體積分數）的大豆精油進行實驗。添加后分析發酵的生物量和β-胡蘿卜素產量，結果如圖1所示。

圖1 大豆精油對B.trispora發酵的影響Fig.1 The effect of soybean oil on the B.trispora fermentation

2.2 棉子粗油對發酵的影響

在發酵基本培養基的基礎上分別添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%%、4.0%、5.0%（體積分數）的棉籽粗油進行實驗。添加棉籽粗油后分析發酵的生物量和β-胡蘿卜素產量結果如圖2所示。

2.3 表面活性劑Span80對發酵的影響

圖2 棉籽粗油對B.trispora發酵的影響Fig.2 The effect of cottonseed oil on the B.trispora fermentation

進行表面活性劑條件優化時，在發酵基本培養基的基礎上添加 0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%（體積分數）的表面活性劑Span80進行實驗。分析發酵的生物量和β-胡蘿卜素產量，結果如圖3所示。

圖3 表面活性劑Span80對B.trispora發酵的影響Fig.3 The effect of surfactant Span80 on the B.trispora fermentation

2.4 表面活性劑Tween20對發酵的影響

進行表面活性劑條件優化時，在發酵基本培養基的基礎上添加 0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%（體積分數）的表面活性劑Tween20進行實驗。分析發酵的生物量和β-胡蘿卜素產量，結果如圖4所示。

圖4 表面活性劑Tween20對B.trispora發酵的影響Fig.4 The effect of surfactant Tween20 on the B.trispora fermentation

2.5 無機氮源硝酸鈉對發酵的影響

不同的有機氮源和無機氮源對生物量和β-胡蘿卜素產量的影響不一樣。在發酵基本培養基的基礎上分別添加 0%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%（w/v）的無機氮源硝酸鈉進行實驗。分析發酵的生物量和β-胡蘿卜素產量，結果如圖5所示。

圖5 無機氮源硝酸鈉對B.trispora發酵β-胡蘿卜素含量的影響Fig.5 The effect of Inorganic nitrogen source sodium nitrate on βcarotene by mated culture of B.trispora

2.6 有機碳源丙二酸鈉對發酵的影響

培養基一般使用的有機碳源有：單糖、雙糖、多糖、油脂和脂肪酸等。對于調節微生物生長代謝情況也是極其重要的，影響到目標產物的合成。在發酵基本培養基的基礎上分別添加0%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%（w/v）的有機碳源丙二酸鈉進行實驗。分析發酵的生物量和β-胡蘿卜素產量，結果如圖6所示。

圖6 有機碳源丙二酸鈉對B.trispora發酵的影響Fig.6 The effect of organic carbon source sodium malonate on βcarotene by mated culture of B.trispora

3 討論

3.1 植物油對B.trispora發酵的影響

大豆精油的添加對B.trispora發酵的生物量提高有非常重要的作用，圖像整體呈現升高趨勢。隨著大豆精油的添加量增多，菌體的生物量明顯升高，在添加量為5.0%（體積分數）時有最大值5.06 g，不添加大豆精油時的生物量僅為0.77 g，菌體幾乎不生長，添加量為5.0%（體積分數）時的提高率為557.14%，效果極其明顯，為發酵過程中的必需添加物。棉籽粗油的添加對B.trispora發酵的生物量提高有很大幫助，圖像整體呈現升高趨勢，漲幅明顯。隨著棉籽粗油的添加量增多，菌體的生物量明顯升高，在添加量為5.0%（體積分數）時有最大值6.34 g，不添加棉籽粗油時菌體幾乎不生長，添加棉籽粗油對提高菌體生物量的作用極其明顯，是發酵過程中的重要添加物。比較大豆精油和棉籽粗油對B.trispora的生物合成量的影響發現，二者均在添加量為5.0%（體積分數）時有最大值，但是后者比前者提高了25.30%，可見在生物量方面，5.0%（體積分數）棉籽粗油效果最好。

大豆精油的添加對B.trispora發酵的β-胡蘿卜素含量提高有非常重要的作用，圖像整體呈現升高趨勢，漲幅明顯，在添加量1.5%（體積分數）后有小幅回落。大豆精油的添加使得菌體產生的β-胡蘿卜素含量明顯升高，在添加量為1.5%（體積分數）時有最大值133.5mg/L，不添加大豆精油時的生物量僅為6.573mg/L，菌體幾乎不合成產物，添加量為1.5%（體積分數）時的提高率為1 931.04%，效果極其明顯，為發酵過程中的必需添加物。棉籽的添加對B.trispora發酵的β-胡蘿卜素含量提高也有非常大的作用，圖像整體呈現先升高，再下降趨勢，在添加量1.5%（體積分數）后明顯下降。在添加量為1.5%（體積分數）時有最大值80.232 mg/L，不添加大豆精油時菌體幾乎不合成產物，添加量為1.5%（體積分數）時效果極其明顯，為發酵過程中的重要添加物。比較大豆精油和棉籽粗油對B.trispora的β-胡蘿卜素含量的影響發現，二者均在添加量為1.5%（體積分數）時有最大值，但是大豆精油的效果優于棉籽粗油，可見在β-胡蘿卜素含量方面，添加1.5%（體積分數）大豆精油效果最好。

3.2 表面活性劑對B.trispora發酵的影響

表面活性劑是一類分子中含有親水基和親油基，即雙親結構的有機化合物。研究證明，表面活性劑影響微生物產酶活性的機理應該是在促進菌體生長的同時，改變了細胞表面性質和堆料環境中的界面張力及膠團性質，促進了酶的釋放和介質的分散吸收。絲狀真菌在液體培養基中的菌體形態對發酵生產有非常重要的影響。一方面，菌體形態影響培養液的流體特性和傳質特性；另一方面，菌體形態是微生物生理學和代謝的表達。根據其特性，微生物在發酵液中的菌體形態，可以分為：菌絲球聚集體、粗糙菌絲球、平滑菌絲球、菌絲塊、分散菌絲體[11]。另有研究表明[12]，菌絲形態會受到菌株內外兩方面的因素的影響。比如，基因、細胞壁結構、營養成分、攪拌、培養液粘度、表面活性劑的添加等，都會對發酵的菌體形態造成影響，進而影響菌體的生長和代謝，影響代謝產物的生成。文獻中報道，有些添加物，如表面活性劑、煤油等的添加，會改變發酵的菌絲形態，從而影響菌體的生長和產物的合成。在B.trispora發酵培養基中加入合適的表面活性劑，β-胡蘿卜素產量有很大程度的提高[13]。非離子型表面活性劑能防止菌絲體在生長過程中的聚集，因而液體培養基中的營養成分能快速進入菌絲細胞，為細胞生長代謝所利用。我們選用了兩種非離子型表面活性劑Span80和Tween20分別考察對B.trispora發酵的影響。通過圖3和4的數據可以看出Span80對B.trispora發酵的生物量提高沒有幫助，整體在小范圍內波動，但是各個濃度下的生物量均低于不添加時的含量。Tween20對B.trispora發酵的生物量提高也沒有幫助，各個濃度下的生物量均明顯低于不添加時的含量。而對于β-胡蘿卜素產量的影響則不同，Span80的添加使得B.trispora發酵的β-胡蘿卜素含量出現先上升再下降趨勢，雖然在添加量為0.5%（體積分數）時出現最大值117.003 mg/L，但是相對空白值108.167 mg/L僅提高了8.17%，效果并不明顯。Tween20的添加使得B.trispora發酵的β-胡蘿卜素含量出現先上升再下降趨勢，在添加量為0.5%（體積分數）時出現最大值133.105mg/L，相對空白值108.167mg/L提高了23.06%，效果比較明顯。因此在這兩種表面活性劑中，添加0.5%（體積分數）的Tween20是提高菌體β-胡蘿卜素含量的最優條件。分析原因，可能是因為兩者的HLB值不同（Span80的HLB值為4.3，Tween20的HLB值為16.7）HLB值越大，表示該表面活性劑的親水性越強，Tween20的水溶性比Span20要好，故在發酵培養基中的溶解性Tween20更有優勢，便于利用。

3.3 無機氮源對B.trispora發酵的影響

氮是構成微生物細胞中核酸和蛋白質的重要元素，可以影響代謝過程所需酶的合成，同時氮源對于微生物的生長和代謝也是非常重要的，無機氮源和有機氮源都是影響微生物目標產物形成和微生物菌體本身生長的關鍵因素，對于B.trispora也不例外。如圖6所示無機氮源硝酸鈉對B.trispora發酵的生物合成量起到抑制，圖像呈現明顯的下降趨勢，隨著硝酸鈉的添加量增大，生物合成量不斷降低，降幅明顯，可見無機氮源硝酸鈉對B.trispora發酵的生物合成起到阻礙作用。無機氮源硝酸鈉對提高B.trispora發酵的β-胡蘿卜素含量沒有作用，圖像呈現明顯的下降趨勢，隨著硝酸鈉的添加量增大，β-胡蘿卜素含量不斷降低，降幅明顯，可見無機氮源硝酸鈉對B.trispora發酵的β-胡蘿卜素含量起到阻礙作用。

綜合評價無機氮源硝酸鈉對于B.trispora的生物合成量和β-胡蘿卜素含量均起到抑制作用，因此不適合作為培養基添加物。

3.4 有機碳源對B.trispora發酵的影響

碳源是構成微生物細胞結構和代謝產物中碳架來源的重要營養物質。微生物利用碳源物質具有選擇性，不同的微生物或原生長環境不同的同種微生物，對碳源的利用是有區別的。如圖5所示有機碳源丙二酸鈉的添加對B.trispora發酵的生物量提高有一定的作用，圖像整體呈現升高，下降趨勢，漲幅較為明顯，在添加量2.0%（w/v）后有小幅回落。有機碳源丙二酸鈉使得菌體的生物量有所升高，在添加量為2.0%（w/v）時有最大值5.63 g，不添加丙二酸鈉時的生物量為5.11 g，提高了 10.18%。

有機碳源丙二酸鈉的添加對B.trispora發酵的β-胡蘿卜素含量提高有重要的作用，圖像整體呈現先升高后下降趨勢，在添加量為1.0%（w/v）時有最大值112.326 mg/L，不添加時的β-胡蘿卜素含量僅為71.566 mg/L，提高率為56.95%，效果非常明顯。因此添加1.0%（w/v）的丙二酸鈉對B.trispora發酵的β-胡蘿卜素含量提高有很大的幫助，是提高其產量的一種有效手段。

綜合評價有機碳源丙二酸鈉對于B.trispora的生物合成量和β-胡蘿卜素含量均起到提高作用，添加量為2.0%（w/v）時生物量提高了10.18%。添加量為1.0%（w/v）時β-胡蘿卜素含量提高率為56.95%，效果非常明顯。因此在培養基中添加1.0%（w/v）的丙二酸鈉對B.trispora發酵的β-胡蘿卜素含量提高有很大的幫助，可以優化發酵結果。

4 結論

發酵培養基是用于生產預定發酵產物的培養基，是供菌體生長、繁殖和合成產物之用。它既要使種子接入培養基后能迅速生長，達到一定的菌體濃度，更重要的是使長好的菌體能迅速合成所需產物[14]。我們對培養基成分進行初步確定，以達到最大量的發酵最終產物β-胡蘿卜素。以β-胡蘿卜素的發酵產量作為監測的主要指標，菌體的干重為參考指標選擇發酵培養基。為進一步培養條件的優化提供基礎。

取原始正菌（+）和原始負菌（-）按照1∶4混合培養，在基礎培養基上分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3%（體積分數）的span80和Tween20；0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%（體積分數）的大豆精油和棉籽粗油；0.25%0.5%0.75%1%（w/v）的無機氮源硝酸鈉；0.5%、1.0%、2.0%、3.0%（w/v）的有機碳源丙二酸鈉進行發酵培養，檢測產物的生物量和β-胡蘿卜素含量，通過分析數據得出較優的添加物及其濃度。經過大量的發酵實驗得出以下結論：

1）比較Span80和Tween20兩種表面活性劑對B.trispora的β-胡蘿卜素含量的影響發現，在添加量為0.5%（體積分數）時出現最大值133.105 mg/L，相對空白值108.167 mg/L提高了23.06%，效果比較明顯，添加0.5%（體積分數）的Tween20是提高菌體β-胡蘿卜素含量的最優條件。

2）比較大豆精油和棉籽粗油對B.trispora的β-胡蘿卜素含量的影響發現，二者均在添加量為1.5%（體積分數）時有最大值，且添加1.5%（體積分數）大豆精油效果最好。

3）比較不同添加量的無機氮源硝酸鈉對于B.trispora的生物合成量和β-胡蘿卜素含量均起到抑制作用，因此不適合作為培養基添加物。

4）比較不同添加量的有機碳源丙二酸鈉對于B.trispora的生物合成量和β-胡蘿卜素含量，發現丙二酸鈉的添加量為1.0%（w/v）時β-胡蘿卜素含量有最大值112.326 mg/L，不添加時僅為71.566 mg/L，提高了56.95%。因此添加1.0%（w/v）的丙二酸鈉對β-胡蘿卜素含量提高有很大的幫助，可以優化發酵結果。

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