MEKC在線推掃富集法檢測蔬菜中殘留甲基對硫磷

李月秋，杜光玲，李軍，趙燕燕，韓媛媛，劉麗艷

（河北大學醫學實驗中心，河北保定071000）

MEKC在線推掃富集法檢測蔬菜中殘留甲基對硫磷

李月秋，杜光玲，李軍，趙燕燕*，韓媛媛，劉麗艷

（河北大學醫學實驗中心，河北保定071000）

建立膠束電動色譜在線推掃富集法檢測蔬菜中殘留的痕量甲基對硫磷。討論了十二烷基硫酸鈉（SDS）濃度、NaH2PO4濃度、緩沖液pH、有機溶劑添加量、樣品中電解質濃度、運行電壓、進樣壓力對富集效果的影響；考察了活性炭凈化對回收率的影響。結果：選擇20mmol/L磷酸二氫鈉+180 mmol/LSDS（pH=6.2），甲醇10%（體積分數）為緩沖液，電壓7 kV，進樣壓力2062.5KPa×s。1.8g活性炭的加入對回收率沒有明顯的影響。甲基對硫磷在0.03mg/L～2.5mg/L范圍內線性關系良好，相關系數為0.999 6，檢測限為0.011 5mg/L。加標水平在0.4mg/kg～0.6mg/kg范圍內，回收率為90.44%～90.63%，RSD為1.12%～1.16%。膠束電動色譜在線推掃富集法可用于蔬菜中殘留痕量農藥的檢測。

膠束電動色譜；在線推掃富集；蔬菜；殘留；甲基對硫磷

甲基對硫磷是應用廣泛的高毒﹑高殘留有機磷殺蟲劑，由于其毒性較高，造成了環境污染，嚴重威脅了人類健康，近年來已在蔬菜水果上禁止使用。因此發展靈敏可靠和實用的甲基對硫磷痕量分析檢測技術對保證食品安全及人體健康，促進進出口貿易的正常進行有著深遠意義。

目前，蔬菜、水果﹑糧食等農產品中甲基對硫磷的常用檢測方法為氣相色譜法[1-4]，氣相色譜質譜法[5-8]，液相色譜法[9-12]，液相色譜質譜法[13]。這些方法靈敏度高、方法較為成熟，但樣品往往需經過離線濃縮等過程，操作繁瑣，測定成本高。

毛細管電泳法具有樣品用量少、分析成本低、適用范圍廣等特點，尤其膠束電動毛細管色譜法（micellar electrokinetic chromatography，MEKC）將毛細管電泳的分析對象從帶電離子推廣到中性物質，擴展了毛細管電泳的應用范圍。它和所有毛細管電泳方法一樣，由于受檢測器、檢測光程和進樣量限制，檢測靈敏度不是很高，應用于痕量分析時受到一定限制。在線推掃富集技術是近幾年發展起來的提高檢測靈敏度的方法之一，因具有較高的檢測靈敏度且操作簡單，經濟實用而有廣泛的應用前景。已有膠束電動色譜法分離測定河水[14]及土壤[15]中甲基對硫磷的報道。費新平[16]等應用毛細管電泳-安培檢測法分離測定了大棚生菜中殘留的甲基對硫磷。David等[17]應用毛細管電泳在線推掃富集技術測定了果汁樣品中12種氨基甲酸酯類農藥。目前未見膠束毛細管電泳在線推掃富集技術檢測蔬菜中殘留的甲基對硫磷的報道。本文利用膠束毛細管電泳結合在線推掃富集技術對蔬菜中殘留的痕量甲基對硫磷進行了富集和檢測，彌補了毛細管電泳檢測靈敏度低的缺點，大大減化了操作過程，為蔬菜中殘留的痕量藥物檢測提供了一種簡便可靠的方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

3000型毛細管電泳儀：美國Bio-Rad公司；內設恒溫系統和高速掃描紫外檢測器；DELTA-320型酸度計：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；BS224S型電子分析天平：北京塞多利斯天平有限公司；ATC2-5-U型高端純水機：重慶頤洋企業發展有限；DS-1型高速組織搗碎機：上海標本模型廠；HY-4型多功能振蕩器：金壇市醫療儀器廠；K.D.濃縮器。

甲基對硫磷標準品（含量90.0%，國家農藥質量監督檢驗中心）；十二烷基硫酸鈉（SDS）（sigma公司）、碳酸氫鈉、磷酸二氫鈉、甲醇為優級純；氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、丙酮、二氯甲烷、無水Na2SO4、為分析純試劑；水為去離子水，電阻率為180 kΩ·m。

1.2 方法

1.2.1 標準品制備

精密稱取甲基對硫磷標準品0.002 60 g，用甲醇定容在10mL容量瓶中，此即標準貯備液，于冰箱冷藏溫度下保存。臨用前將前述標準貯備液用0.5mmol/L磷酸鹽溶液稀釋制得標準溶液。

1.2.2 樣品制備

取蔬菜試樣，置于高速組織搗碎機中攪打。然后稱取50.00 g，置于300mL三角瓶中，加入50mL水和100mL丙酮，振蕩提取1 h。提取液經濾紙過濾，向過濾液中加入10 g～15 g氯化鈉使溶液達到飽和狀態，猛烈振搖2min～3min，靜置10min，使丙酮從水相中鹽析出來，水相用50mL二氯甲烷振搖2min，再靜置分層。將丙酮與二氯甲烷提取液合并，向其中加入1.8 g活性碳，靜置10min脫色。然后經裝有30 g無水硫酸鈉的玻璃漏斗脫水，濾入三角瓶中，再以約40mL二氯甲烷分數次洗滌容器和無水硫酸鈉、洗滌液并入三角瓶中。用K.D.濃縮器于40℃水浴中濃縮至0.2mL。

1.2.3 電泳條件與操作

未涂層熔硅彈性石英毛細管（河北永年光纖廠），柱長50 cm×50μm（有效長度45.5 cm）；運行緩沖液：20mmol/L磷酸二氫鈉—180mmol/LSDS（pH=6.2），甲醇添加量為10%（體積分數）；分離電壓為7 kV；進樣壓力為2 062.5 kPa×s；紫外檢測波長272 nm；分離柱柱溫25℃。

實驗前，毛細管柱分別用水、1.0mol/L鹽酸、水、1.0mol/L氫氧化鈉、水的順序清洗毛細管各1min，然后再用背景緩沖液沖洗2min。

2 結果與討論

2.1 SDS濃度對富集倍數的影響

試驗中，固定分離電壓、進樣壓力，考察了緩沖液濃度為40mmol/LNaH2PO4（pH=7.2）時，不同SDS濃度（60、80、100、120、150、180、200、300mmol/L）對富集倍數的影響。結果表明：當SDS濃度小于180mmol/L時，隨SDS濃度增大，富集倍數增加；當SDS濃度大于180mmol/L時，隨SDS濃度的增加，富集倍數反而下降。因此選擇180mmol/L為最佳SDS濃度。

2.2 NaH2PO4濃度對富集倍數的影響

固定分離電壓、進樣壓力，考察SDS濃度為180 mmol/L（pH=7.2）時，不同NaH2PO4濃度（10、20、40、60、80、100mmol/L）對富集倍數的影響。結果表明：甲基對硫磷的富集倍數隨NaH2PO4濃度改變而變化，且當NaH2PO4濃度為20mmol/L時，富集倍數最大。因此選擇20mmol/L為最佳NaH2PO4濃度。

2.3 緩沖溶液pH對富集倍數影響

固定分離電壓、進樣壓力、NaH2PO4和SDS濃度，測定在不同pH（5.8～8.5）時樣品的峰高。實驗表明：隨緩沖液pH的增加，甲基對硫磷的富集倍數減少，且pH為6.2時，富集倍數比pH為8.2時增加了大約55倍。可知，pH對富集倍數有較明顯影響。因此，試驗中緩沖溶液的pH調至6.2。

2.4 有機溶劑的添加對富集倍數的影響

固定分離電壓、進樣壓力，考察NaH2PO4濃度為20mmol/L，SDS濃度為180mmol/L（pH 6.2）時，不同添加量甲醇（0%、5%、10%、15%、20%、25%，體積分數）對富集倍數的影響。結果表明：甲醇的添加對甲基對硫磷的富集倍數有所改善，當甲醇的添加量為10%時，甲基對硫磷獲得了最大富集倍數，故試驗中選用10%的甲醇添加量。

2.5 樣品中電解質濃度對富集倍數的影響

試驗中，應用NaH2PO4溶液對甲基對硫磷標準貯備液進行稀釋，固定分離電壓、進樣壓力，考察NaH2PO4濃度為20mmol/L，SDS濃度為180mmol/L，甲醇10%（體積分數）（pH6.2）時，不同稀釋溶液濃度（0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mmol/L）對富集倍數的影響。結果表明：當NaH2PO4濃度為0.5mmol/L時，獲得的富集倍數最佳。故試驗中用0.5mmol/LNaH2PO4稀釋樣品溶液。

2.6 運行電壓對富集倍數的影響

實驗中固定其他條件，考察了不同運行電壓（5、7、9、11、13、15KV）對富集倍數的影響。隨著電壓升高，甲基對硫磷的富集倍數明顯減小，又隨電壓升高，遷移時間明顯縮短。試驗中，綜合考慮富集倍數及遷移時間，選取7 KV電壓作為測定甲基對硫磷時的運行電壓。

2.7 進樣壓力對富集倍數的影響

實驗中固定其他條件，考察了不同進樣壓力（687.5 Kpa×s～2 750 Kpa×s）對富集倍數的影響。實驗表明，隨著進樣壓力的增加，富集倍數增加，當進樣壓力為2 062.5 Kpa×s時，富集倍數最佳。因此選擇2 062.5Kpa×s為最佳進樣壓力。

2.8 常規進樣量測定與富集測定比較

如圖1（A）是應用NaH2PO4濃度為20mmol/L，SDS濃度為10mmol/L（pH 7.2）的緩沖溶液，在常規進樣量，即進樣壓力為68.75 kPa×s情況下對0.052 g/L的甲基對硫磷標準溶液測定的電泳情況。圖1（B）是應用NaH2PO4濃度為20mmol/L，SDS濃度為180mmol/L，甲醇10%（體積分數））（pH6.2）的緩沖溶液，在加大進樣量，即進樣壓力為2 062.50 kPa×s情況下對0.001 7g/L甲基對硫磷標準溶液測定的電泳情況。將兩圖進行比較可知，選用SDS作為MECC的準固定相，在加大進樣量情況下，低含量的甲基對硫磷能夠被濃縮檢測，且獲得了較高柱效，富集倍數達到了100.38倍。

2.9 標準曲線及檢出限

在上述優化實驗條件下，采用內標法，以鄰甲苯胺作內標物，通過測定標準系列溶液（2.5、1.7、1.3、1.0、0.5、0.33、0.03mg/L），可得工作曲線為：Y=0.491 8X-0.020 3。

式中：X為甲基對硫磷的濃度（mg/L）；Y為校正峰面積，即甲基對硫磷與內標物峰面積的比值。相關系數為0.999 6，按3倍信噪比計算檢出限為0.011 5mg/L。2.10樣品凈化方法

按照GB/T5009.20-1996樣品前處理方法進行提取、凈化及濃縮時，雜質對甲基對硫磷的測定產生一定程度的影響。

圖1 未富集（A）和富集（B）標準品及樣品（C）電泳圖（*：甲基對硫磷）Fig.1 Electropherogram of no concentration standard（A），concentration standard（B）and sample（C）（*：Folidol）

為消除雜質對測定的干擾，向50 g蒸餾水中加入甲基對硫磷標準品，按照GB/T5009.20-1996樣品前處理方法，進行提取，向合并后的丙酮與二氯甲烷提取液中加入1.8 g活性炭，進一步凈化處理，然后用K.D.濃縮器濃縮，試驗活性炭的添加對測定回收率的影響，結果見表1。

表1 活性炭添加對回收率影響（n=3）Table1 Effect of the added carbon on recovery（n=3）

將兩種方法結果測定值進行t檢驗，從該表中可知統計量值t為0.590 9，查表當自由度為f=4，與顯著水平α=0.05的條件下，t0.05，4=2.78。t＜t0.05，4，說明兩種方法差異不顯著，活性炭的添加對回收率影響不顯著。

蔬菜樣品按照GB/T5009.20-1996樣品前處理方法進行提取，應用1.8 g活性炭進一步凈化處理，然后用K.D.濃縮器于40℃水浴中濃縮至0.2mL，電泳譜圖見圖1（C）。

2.11 精密度和回收率

取韭菜3份，每份分別加入三種不同濃度的甲基對硫磷標準品。按以上實驗方法處理，三次重復測定，加標平均回收率和精密度見表2。

表2 平均回收率及相對標準偏差（n=3）Table2 Average recovery and relative standara deviation

2.12 樣品分析

對保定市菜市場購買的韭菜、菠菜、小白菜樣品按以上試驗條件進行處理，直接進行檢測分析，檢測結果見表3。

表3 樣品分析結果（n=3）Table3 Analytical result of the sample（n=3）

3 結論

本研究探索建立的MEKC在線推掃富集法測定蔬菜中殘留的痕量甲基對硫磷，無需對毛細管電泳儀進行改造，無需與價格昂貴的質譜儀聯用，樣品預處理無需采用固相萃取等離線富集方法，方法簡單、經濟，與已報道的MEKC法[15]相比檢出限有了極大改善，且與氣質法[7]、液相法[12]測定蔬菜和茶葉中的甲基對硫磷的檢出限接近，能夠滿足蔬菜中農藥殘留限量的檢測要求。可見，膠束毛細管電泳在線富集法將成為食品痕量農藥殘留檢測的新方法。

[1]Wang Y L,Zeng ZR,Liu MM,et al.Determination of organophosphorus pesticides in pakchoi samples by Headspace solid phase microextraction coupled with gas chromatography using home-made fiber[J].Eur Food Res Technol,2008,226:1091-1098

[2]羅赟,向仲朝,岳蘊瑤,等.毛細管氣相色譜法同時檢測農產品中17種農藥殘留的研究[J].中國衛生檢驗雜志,2011,21(6):1349-1351

[3]孫巧鶯,李永波,左蓓.氣相色譜法同時測定葉菜中16種有機磷農藥殘留量[J].中國衛生檢驗雜志,2011,21(7):1595-1597

[4]廖懷平,肖倫,張鵬,等.毛細管氣相色譜法同時檢測水果蔬菜中的多種殘留有機磷農藥[J].中國衛生檢驗雜志,2006,16(6):628-683

[5]Tao C J,Hu JY,Li JZ,et al.Multi-residue determination of pesticides in vegetables by gas chromatography/ion trap mass spectr-ometry [J].Bull Environ Contam Toxicol,2009,82:111-115

[6]Pihlstr?m T,Blomkvist G,Friman P,et al.Analysis of pesticide residues in fruit and vegetables with ethyl acetate extraction using gas and liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection[J].Anal Bioanal Chem,2007,389:1773-1789

[7]Cervera M I,Medina C,Portolés T,et al.Multi-residue determination of 130 multiclass pesticides in fruits and vegetables by gas chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry [J].Anal Bioanal Chem,2010,397:2873-2891

[8]張雪梅,楊華梅.液液萃取-氣相色譜-質譜聯用法測定飲用水中19種農藥殘留量[J].理化檢驗:化學分冊,2011,47(7):774-777

[9]張卓旻,陳金泉,張蘭.固相萃取-高效液相色譜聯用分析蔬菜中5種有機磷[J].分析測試技術與儀器,2008,14(2):87-91

[10]陶宏亮,關燕萍,蘇曉峰,等.SPE-HPLC用于蔬菜中甲基對硫磷和對硫磷同時測定[J].華中農業大學學報,2006,25(1):46-49

[11]王紹云,周光明,王莉,等.RP-HPLC同時測定蔬菜中甲基對硫磷和對硫磷的殘留量[J].農藥,2006,45(9):622-624

[12]葉江雷,弓振斌,林芳,等.茶葉中水胺硫磷-亞胺硫磷、甲基對硫磷和伏殺硫磷農藥殘留的高效液相色譜法測定[J].廈門大學學報:自然科學版,2007,46(3):441-444

[13]Botero-Coy AM,Marin JM,IbánezM.Multi-residue determination of pesticides in tropical fruits using liquid Chromatography/tandem mass spectrometry[J].Anal Bioanal Chem,2012,402:2287-2300

[14]王文雷,趙明輝,袁偉棟.毛細管膠束電動色譜法檢測4種有機磷農藥[J].化學分析計量,2005,14(5):21-23

[15]李珊,張蘭,陳國南.毛細管膠束電動色譜分離測定對硫磷、甲基對硫磷、水胺硫磷和克百威[J].福州大學學報:自然科學版,2003, 31(2):219-221

[16]費新平,王立世,張水峰,等.毛細管電泳-安培檢測法對甲基對硫磷﹑對硫磷﹑西維因和速滅威農藥殘留的測定研究[J].分析測試學報,2004,23(5):70-73

[17]Moreno-GonzálezD,Gámiz-Gracia L,García-Campa?a A,et al.Use of dispersive liquid–liquid microextraction for the determ-ination of carbamates in juice samples by sweeping-micellar electrokinetic chromatography[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2011,400 (5):1329-1338

Determination of the Residual Methylparathion in Vegetables by MEKC on-line Sweeping Technique

LI Yue-qiu，DU Guang-ling，LI Jun，ZHAO Yan-yan*，HAN Yuan-yuan，LIU Li-yan
（Medical Experiment Center，Hebei University，Baoding 071000，Hebei，China）

A micellar electrokinetic chromatography（MEKC）Sweeping technique was developed for the determination of methyparathion in vegetables.The effects of the concentration of SDS，the concentration of NaH2PO4，the pH of running buffer，the concentration of organic additive，the concentration of solution to dilute sample，voltage and injection pressure on enrichment effect were discussed.The effect of additiving the activated carbon to sample on recovery was discussed.Results：20mmol/L NaH2PO4+180mmol/L SDS（pH=6.2），10% methanol（V：V）was used as running buffer，the voltage was7 kV，the injection pressure was2 062.5Kpa×s.The recovery was not effected by 1.8g activated carbon adding to the vegetable.The calibration curves had good linearity in the range of 0.03mg/L-2.5mg/L for folidol，the correlation coefficients was 0.999 6，the detection limit was 0.011 5mg/L.At spiked levels of 0.4mg/kg-0.6mg/kg，the recoveries were 90.44%-90.63%，the relative standard deviations was1.12%-1.16%.The MEKC method based on on-line Sweeping technique can be used to detect the residuals of trace pesticides in vegetables.

micellar electrokinetic chromatography；on-line Sweeping；vegetable；residue；methylparathion

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.022

2012-11-09

保定市科學研究與發展計劃（09ZF006）

李月秋（1977—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品、藥品分析。

*通信作者