新型HK-MID-Listeria生化鑒定系統的鑒定效果評估

田亮，盧勉飛，林干，陳霖熙，蔡芷荷，吳清平

（1.廣東環凱微生物科技有限公司，廣東廣州510663；2.廣東省微生物研究所，廣東廣州510663）

新型HK-MID-Listeria生化鑒定系統的鑒定效果評估

田亮1，盧勉飛1，林干1，陳霖熙1，蔡芷荷1，吳清平2，*

（1.廣東環凱微生物科技有限公司，廣東廣州510663；2.廣東省微生物研究所，廣東廣州510663）

對新型HK-MID-Listeria生化鑒定系統的鑒定性能進行評估。以傳統的生化鑒定為基準方法，對分離自食品的101株李斯特氏菌野生株用HK-MID-Listeria和API-Listeria兩種鑒定方法進行鑒定比對。結果表明：HK-MID-Listeria和API-Listeria兩種鑒定系統分別與傳統鑒定方法符合率分別為100%和93.1%；HK-MID-Listeria與API-Listeria兩者的符合率為93.1%。鑒定數據經過統計學處理，HK-MID-Listeria與API-Listeria對李斯特氏菌屬的鑒定結果并無顯著性差異（P＞0.05）。HK-MID-Listeria鑒定李斯特氏菌屬具有快速，簡便的特點，不需要特殊的儀器，成本低廉，更適合應用在食品衛生方面的檢測。

生化鑒定系統；HK-MID；API

李斯特氏菌屬（Listeria）為一種短小的革蘭氏陽性無芽孢桿菌，DNA堿基組成G+C含量為36mol%～38mol%[1-2]，廣泛存在于環境當中，僅部分種對人及動物致病，導致腦膜炎、菌血癥和孕婦早產等[3]。在李斯特氏菌屬中，單增李斯特氏菌（L.Monocytogenes）是一種重要的病原菌，宿主主要是人和動物。人感染李斯特氏菌99%是食用了單增李斯特菌污染的食品，尤其是即食類的食品。在美國每年大約有2 500人患李斯特氏菌病，病死率高達20%～30%[4]。因此，李斯特氏菌的分離和鑒定仍然是當今研究的熱點。

從食品或者臨床樣本分離的李斯特氏菌的鑒定方法主要有以下幾種：一種是基于免疫學的方法主要有Vidas-Lis（法國梅里埃）、Listeria免疫試劑盒（法國Transia產品）和Listeria快速檢測產品（英國Oxoid）等，這些方法都是基于李斯特氏菌單克隆或多克隆抗體，能特異與李斯特氏菌鞭毛蛋白發生免疫學反應，主要是針對李斯特氏菌屬特異性進行鑒定[10]。另外一種是基于數值分類鑒定的方法-細菌數值鑒定法，是數理統計學與細菌鑒定學相結合產生的一種細菌概率鑒定方法。由于其具有快速、鑒定率高、便于實現自動化等優點，現已成為臨床和食品衛生等領域細菌鑒定的主導方法。采用該技術的產品主要有API（Analytic Products INC）鑒定系統、羅氏公司的Micro-ID、Biolog和Microgen-ID鑒定系統等。

本研究旨在利用新型HK-MID-Lister鑒定系統對分離自食品的李斯特氏菌野生株進行鑒定，以便于對HK-MID-Lister鑒定效果進行評估。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培養基和試劑

API-Listeria試劑盒：生物-梅里埃公司；TSA-YE平板、血平板、HK-MID-Listeria鑒定試劑盒和傳統的生化鑒定試劑：廣東環凱微生物科技有限公司提供。

1.1.2 測試菌株

廣東省微生物研究所提供的101株分離自食品的李斯特氏菌野生株，參考了食品安全國家標準李斯特菌檢驗方法[5]，利用傳統的生化試劑對這些菌株進行了鑒定，其中單增李斯特氏菌（L.monocytogenes）69株，英諾克李斯特氏菌（L.innocua）25株，西爾李斯特氏菌（L.seeligeri）2株，威爾斯李斯特氏菌（L. welshimeri）3株，格式李斯特氏菌（L.grayi）2株。

1.2 實驗方法

測試菌株在TSA-YE培養基上進行轉接，按照API-Listeria和HK-MID-Listeria鑒定系統的說明書進行鑒定；傳統方法參考食品安全國家標準食品微生物學檢驗-單核細胞增生李斯特氏菌檢驗[5]。

2 結果與分析

2.1 三種鑒定方法的比較

用傳統方法、API-Listeria和HK-MID-Listeria同時對101株野生分離株進行鑒定，鑒定結果見表1。

2.1.1 API-Listeria、HK-MID-Listeria分別與傳統的方法鑒定比較

從表1中可以得出，與傳統方法對李斯特氏菌屬的鑒定結果相比較，整體符合率HK-MID-Listeria和API-Listeria分別達到了100%和93.1%。傳統方法和HK-MID-Listeria對李斯特氏菌的鑒定完全相符，這兩種鑒定方法都是以糖發酵為主，兩種方法區別單增李斯特氏菌和無害李斯特氏菌都應用了關鍵性的試驗-溶血試驗。而API-Listeria有兩個測定酶的反應：甘露糖苷酶和芳基酰胺酶試驗（DIM）。由此可見，生化反應原理的差異可以引起具體結果的不同。

表1 三種方法鑒定結果的符合率Table1 The coincidence rate of the three methods

2.1.2 API-Listeria和HK-MID-Listeria的鑒定比較

從表1中我們可以得出，API-Listeria和HK-MIDListeria兩種方法的符合率為92.1%（93/101×100%）。其中，有2株單增李斯特氏菌不相符，其中1株單增李斯特氏菌API-Listeria不能鑒定，API的生化反應DIM，RIB（甘露糖苷酶）兩個生化反應全為陽性，與李斯特菌的典型生化反應不符。補做傳統的RIB生化實驗和溶血性試驗進行鑒定，接種血平板出現溶血環，為溶血性反應，RIB結果為陰性，該菌株鑒定為單增李斯特氏菌。另外1株單增李斯特氏菌，API-Listeria鑒定為英諾克李斯特氏菌，其中DIM實驗為陽性，補做血平板的實驗，出現了溶血，這兩株菌鑒定為單增李斯特氏菌。此外，API-Listeria對1株英諾克李斯特氏菌、2株西爾李斯特氏菌、1株威爾李斯特氏菌和1株格式李斯特氏菌不能給出鑒定結果。

2.2 HK-MID-Listeria和API-Listeria的鑒定差異

應用兩種鑒定系統對李斯特菌屬的菌株進行鑒定的數據經過統計學處理，結果見表2，HK-MIDListeria鑒定系統和API-Listeria鑒定系統二者之間并無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 HK-MID-Listeria和API-Listeria鑒定李斯特氏菌結果差異Table2 Identification difference of API-Listeria and HK-MID-Listeria

3 討論

3.1 兩種鑒定方法的使用方便性和培養時間

通過本實驗的初步研究，可以得出，兩種鑒定系統在鑒定李斯特菌屬方面并無顯著差異。Microgen公司的HK-MID-Listeria鑒定條已通過了國際AOAC的認證。其鑒定系統中含有的12種生化反應中，有3種特征性反應：七葉苷、阿拉伯糖和海藻糖，這3種生化反應中任意一種為陰性即可判定鑒定的菌株為非李斯特菌屬，這3種生化反應可以提高HK-MIDListeria鑒定結果的準確性[6]。HK-MID-Listeria的接種和培養明顯優于API-Listeria，一方面對菌懸液的濃度沒有嚴格的要求；另外，HK-MID-Listeria鑒定條上面覆蓋有封口薄膜，可以防止在培養過程中液體過度蒸發，不需要額外維持濕室的濕度。此外，HK-MIDListeria可以從選擇性平板或者顯色培養基平板上挑取單菌落進行鑒定；而API-Listeria對于鑒定的可疑菌落要求在非選擇性平板上生長的純培養物，無論使用方便性還是鑒定過程的時間都明顯優于API的鑒定方法。

3.2 單增李斯特和英諾克利特特異性的生化反應

在李斯特氏菌鑒定中，單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌生物學特征和生化反應基本一致，但是，單增李斯特氏菌能夠產生溶血素，這也成為單增李斯特氏菌與英諾克李斯特氏菌區別的關鍵性反應。

HK-MID-Listeria鑒定系統利用了這個非常重要的生化反應-溶血實驗，用來區分單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌。在鑒定條上，第12孔為空白孔，添加血紅素到加有100μL菌懸液的第12個空的孔中培養，通過是否產生沉淀分層即可判斷陰陽性，因此HK-MID-Listeria的鑒定實驗不需要做溶血的補充實驗。

API-Listeria鑒定系統也設計了用于區分單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌的特異性試驗：“DIM”即芳基酰胺酶試驗。“DIM”的反應結果通過顏色變化來判讀，陽性反應為橙色，陰性反應為淡粉色或淺橙色，由于各種因素的影響，如：添加試劑不穩定等因素，常常會造成反應結為中間色，結果判讀比較困難，容易導致誤判。API-Listeria鑒定系統的“DIM”的反應并不能完全替代溶血反應，需要補充溶血性試驗。

本實驗中，API-Listeria鑒定系統對幾個菌株不能鑒定其模式菌與其數據庫有很大的關系。APIListeria鑒定系統的數據庫主要是根據常見李斯特氏菌和臨床分離樣本建立的數據庫，致使從食品中分離的部分菌株的生化反應模式不包含在API-Listeria的數據庫中[7]。

HK-MID-Listeria鑒定系統模式菌數據庫是基于從食品、藥品和臨床診斷等分離的菌株的鑒定來建立的。因此，HK-MID-Listeria鑒定系統更適合應用從食品、藥品中分離的李斯特氏菌的鑒定。相對于APIListeria鑒定系統來說，HK-MID-Listeria鑒定系統的數據庫中缺乏環境如土壤等中李斯特氏菌的數據。

[1]Pongpan L,Scott AJ,Mark KM,et al.High Density Microarray Analysis Reveals New Insights into Genetic Footprints of Listeria monocytogenes Strains Involved in Listeriosis Outbreaks[J].PLoS One,2012,7(3):e32896

[2]王秀茹.預防醫學微生物學及檢驗技術[M].北京:人民衛生出版社,2002

[3]Abram M,Schlüter D,Vuckovic D,et al.Murine model of pregnancyassociated Listeria monocytogenes infection[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2003,35(3):177-182

[4]Roberts AJ,Williams SK,Wiedmann M,et al.Some Listeria monocytogenes Outbreak Strains Demonstrate Significantly Reduced Invasion,inlA Transcript Levels,and Swarming Motility In Vitro[J]. Appl Environ Microbiol.,2009,75(17):5647-5658

[5]中華人民共和國衛生部(發布).GB4789.30-2010食品安全國家標準-食品衛生微生物學檢驗-單核細胞增生李斯特氏菌檢驗[S].北京:中國標準出版社,2010:2

[6]蘇麗春,蔡芷荷,陳素云,等.一種新的細菌生化鑒定系統-Microgen ID[J].中國衛生檢驗雜志,2010,20(2):315-318

[7]謝小保,歐陽友生,陳儀本,等.API系統鑒定化妝品及一次性衛生用品微生物種類的研究[J].微生物學雜志,2002,22(1):7-11

Evaluation of the New Biochemical Identification System-HK-M ID-Listeria

TIAN Liang1，LU Mian-fei1，LIN Gan1，CHEN Lin-xi1，CAI Zhi-he1，WU Qing-ping2，*
（1.Guangdong Huankai Microbial Sci.＆Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，Guangdong，China；2.Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510663，Guangdong，China）

Identification performance of the new HK-MID-Listeria biochemical identification system was assessed.Based on traditional biochemical identification method，the HK-MID-Listeria identification system has been compared with that of the API-Listeria for the identification of101wild strains isolated from food.Results showed：the coincidence rate of the HK-MID-Listeria and the API-Listeria respectively compared with the traditional biochemical identification methods were 100%and 93.1%；The coincidence rate of the HK-MIDListeria compared with API-Listeria the was 93.1%.Base on the statistical analysis，there is no significant difference among two identification system（P＞0.05）in this study.The new HK-MID-Listeria biochemical identification system has a good prospect in estimating to be attributable to consumption of foods contaminated by Listeria.BecauseHK-MID-Listeria is a rapid，simple and economical method to identify Listeria.

biochemical identification system；HK-M ID；API

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.023

2013-02-27

廣東省財政廳項目（2011S-P1881）

田亮（1984—），男（漢），研究生，主要從事衛生微生物檢驗技術研究。

*通信作者