敲低Txnip抑制高糖誘導的人腎小管細胞系凋亡

韋金英，史永紅，任韞卓，侯延娟，杜春陽，張連珊，段惠軍

(河北醫科大學病理學教研室，河北石家莊050017)

研究表明，高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡是導致糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的一個主要機制。高血糖引起的活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生對DN 的發展具有至關重要的作用［1］，ROS產生的主要部位是線粒體，在糖尿病血管并發癥中發揮重要作用［2］。以往的研究顯示硫氧化蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，Txnip)參與了高糖(high glucose，HG)誘導胰島β 細胞凋亡［3］。前期實驗研究也發現敲低Txnip表達抑制高糖誘導的小鼠系膜細胞凋亡是通過線粒體途徑實現的，且與P38MAPK 信號的活化密切相關［4］。Txnip 可能在氧化應激造成腎損傷過程中發揮關鍵性調節作用，減少糖尿病腎臟Txnip 的水平可能成為治療糖尿病腎損傷的有效靶點。因此，本實驗旨在觀察Txnip 與高糖狀態下腎小管細胞凋亡的關系以及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小管細胞HK-2(美國標準生物品收藏中心)。兔抗Txnip、cleaved caspase-3、P38 MAPK、P-P38 MAPK(Cell signaling 公司)。小鼠抗BAX 單克隆抗體(P-19)，兔抗BCL-2、caspase-3 和細胞色素c 多克隆抗體以及pro-light HRP 化學發光檢測試劑(Tingen biotech 公司)。TUNEL 試劑盒(Promega 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組刺激實驗:常規培養細胞，待HK-2 細胞達75% ～85%匯合后，用無血清培養基同步24 h。分成4 組:正常糖組(5.6 mmol/L 葡萄糖，NG);高糖組(30 mmol/L 葡萄糖，HG)，高糖+質粒載體對照組(control shRNA Plasmid，HG+C)，高糖+VDUP1 shRNA Plasmid 組(HG +shRNA)。于刺激48 h 后收集細胞觀察。

1.2.2 末端脫氧核苷酸轉移酶介導dUTP 缺口標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡:細胞接種于8 孔Lab-Tek? 腔室玻片上，分組刺激48 h。DeadEndTM熒光TUNEL 系統檢測細胞凋亡。熒光顯微鏡下計數每個高倍視野中陽性染色細胞數和總細胞數，計算陽性細胞百分比。

1.2.3 Western 印跡檢測:加入細胞裂解液，冰浴2 h，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，Lowry 法測定上清液蛋白濃度。按照Huang 等［5］所述方法分離線粒體和不含線粒體的胞質蛋白，本次實驗使用不含線粒體胞質蛋白。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后電轉移至PVDF 膜;質量分數0.05 的脫脂奶粉封閉PVDF 膜2 h，分別加入caspase-3、cleaved caspase-3、P38 MAPK、P-P38 MAPK、BAX、BCL-2 以及細胞色素c 抗體，4 ℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或兔抗體(1∶4 000稀釋)，37 ℃孵育2 h;洗膜后加ECL試劑，ODYSSEY 遠紅外雙色熒光成像系統顯影(LI．COR Gene Company，USA 奧德賽公司)。用美國UVP 公司LabWorks 4.5 分析系統軟件對Western 條帶進行定量分析。

1.2.4 熒光實時定量PCR 檢測Txnip、BAX 和BCL-2 表達變化:Trizol 法提取細胞總RNA，進行反轉錄。熒光實時定量PCR 采用20 μL 反應體系，

SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)10 μL，ROX Reference Dye(50 ×)0.4 μL，反轉錄產物2 μL，上、下游引物(終濃度為1 ng/mL)各0.8 μL，雙蒸水6 μL。反應條件為:95 ℃30 s →95 ℃5 s→55 ℃30 s→72 ℃30 s 共40 個循環。根據比較法計算基因表達相對量，采用公式2－ΔΔCt計算基因表達的相對倍數變化。引物序列(表1)。

表1 實時定量PCR 引物列表Table 1 Primer sequences used for RT-PCR and Real-time PCR analysis

1.2.5 流式細胞術(FCM)檢測細胞內ROS:使用熒光探針5-(6)-羧基-2，7-二氯熒光素(CM-DCHFDA，Invitrogen)檢測細胞內ROS 含量。HK-2 分組刺激48 h，最后加入含10 umol/L DCHF-DA 的染液，37°C 避光孵育30 min，PBS 洗滌，胰蛋白酶消化，懸浮于PBS 中，流式細胞儀檢測。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 敲低Txnip 對高糖誘導的腎小管上皮Txnip的影響

與NG 組相比，HK-2 細胞Txnip 顯著增加(P＜0.01);與HG 組相比，敲低Txnip 能夠顯著減少高糖誘導的Txnip 表達(P＜0.05)(表2)。

2.2 敲低Txnip 對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響

與NG 組相比，在高糖刺激48 h，HK-2 凋亡細胞數顯著增加(P＜0.01);與HG 組相比，敲低Txnip能夠顯著減少高糖誘導的細胞凋亡數(P＜0.05)(圖1)。

表2 敲低Txnip 對HG 誘導的人腎小管上皮細胞Txnip蛋白表達及Txnip mRNA 的影響Table 2 Effect of Txnip interference on Txnip in HK-2(n=6)

2.3 敲低Txnip 對高糖誘導的小管上皮細胞凋亡相關指標影響

與NG 組相比，HG 糖組cleaved caspase-3 表達和BAX/BCL-2 比率顯著增加(P＜0.01);敲低Txnip能夠顯著抑制HG 誘導的cleaved caspase-3 表達和BAX/BCL-2 比率(P＜0.05)(圖2，表3)。

2.4 敲低Txnip 對HG 誘導的小管上皮線粒體細胞色素c 釋放的影響

與正常糖對照組相比，高糖組胞質中的細胞色素c 水平明顯增加(P＜0.01);與高糖組相比，Txnip敲低組細胞胞質中細胞色素c 水平明顯降低(P＜0.05)(圖3)。質粒載體對照組與正常對照組相比，胞質中細胞色素c 水平無明顯差異。

圖1 原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測敲低Txnip 對HG 誘導的人腎小管上皮細胞凋亡的影響Fig 1 Effect of Txnip interference on HG-induced apoptosis of HK-2 is analyzed by TUNEL(n=6)(×200)

圖2 敲低Txnip 對HG 誘導人腎小管上皮細胞cleaved caspase-3、BAX 和BCL-2 蛋白表達影響Fig 2 Effect of Txnip interference on activation of caspase-3 and expression of BAX and BCL-2 in HK-2(n=6)

表3 敲低Txnip 對HG 誘導的人腎小管上皮細胞BCL-2 mRNA、BAX mRNA 表達的影響Table 3 Effect of Txnip interference on BCL-2 and BAX mRNA in HK-2(n=6)

圖3 敲低Txnip 對HG 誘導的人腎小管上皮細胞線粒體細胞色素C 釋放的影響Fig 3 Effect of Txnip interference on the release of cytochrome c from mitochondria to cytoplasm in HK-2(n=6)

2.5 敲低Txnip 對HG 誘導的小管上皮細胞ROS產生的影響

與正常糖對照組相比，高糖組HK-2 細胞ROS產生顯著升高(P＜0.01);Txnip 敲低組細胞ROS表達明顯低于高糖組(P＜0.05)(圖4)。質粒載體對照組與正常對照組相比，ROS 水平無明顯差別。

2.6 敲低Txnip 對HG 誘導小管上皮細胞P38 MAPK 激活的影響

與NG 組相比，HG 組P38 MAPK 的磷酸化水平明顯升高(P＜0.01);與高糖組相比，Txnip 敲低組P38 MAPK 磷酸化水平明顯降低(P＜0.05)(圖5)。

3 討論

既往研究提示ROS 對細胞內級聯反應起著調節作用，ROS 的過量生成導致了氧化應激、細胞功能喪失及細胞凋亡。在糖尿病時，腎臟存在大量ROS 的蓄積，破壞了腎臟組織內氧化還原動態平衡，造成腎組織氧化應激狀態，參與腎損傷發生與發展。最近研究顯示高糖環境會導致腎臟近端小管細胞線粒體超氧化物生成增多，因此，調節糖尿病腎臟氧化應激狀態有可能成為有效的治療糖尿病腎病的靶點。Txnip 又稱維生素D3 上調蛋白1(VDUP-1)或Trx結合蛋白2(TBP-2)，能夠與Trx 的活性位點上的半胱氨酸殘基結合而抑制其活性，改變細胞的氧化還原狀態，誘導氧化應激。Txnip 缺乏腎小球系膜細胞阻斷高糖誘導的氧化應激是通過影響TCA循環與糖酵解葡萄糖流量控制ROS 產生［6］。最近研究也證實，抗氧化劑tempol 以及敲低Txnip 表達均能夠抑制高糖誘導的系膜細胞凋亡［4］。本研究結果顯示，敲低Txnip 能夠抑制HG 誘導的HK-2細胞內ROS 產生，同時抑制細胞凋亡增加，cleaved caspase-3 表達和BAX/BCL-2 比率升高以及促使細胞色素c 從線粒體釋放入胞質。這些結果表明，敲低Txnip 抑制HG 誘導的小管上皮細胞凋亡可能是通過減少ROS 和保護線粒體功能實現的。以上提示，高濃度葡萄糖誘導的HK-2 細胞凋亡和ROS 產生密切相關。

P38 蛋白激酶為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，是一個重要的信號分子。研究表明，P38 MAPK 信號通路可能與DN 有關［7－9］。前期研究也表明，采用SB203580 阻斷P38 MAPK 通路能夠明顯抑制HG誘導的系膜細胞凋亡，cleaved caspase-3 表達和BAX/BCL-2 比率［4］。以上說明，P38 MAPK 信號通路可能與HK-2 細胞凋亡密切相關。本研究中發現，敲低Txnip 能夠顯著抑制HG 誘導的P38 MAPK的活化，提示敲低Txnip 抑制HG 誘導的HK-2 凋亡可能部分是通過調節P38 MAPK 通路活化實現的。綜上所述，敲低Txnip 能夠抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞HK-2 的凋亡，這種作用可能是通過減少ROS 產生，保護線粒體功能以及抑制P38MAPK 信號通路的活化實現的。因此，推測Txnip 可能是一個潛在的糖尿病腎病治療靶點。

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