尋常型銀屑病皮損中血管緊張素II及血管緊張素轉化酶的檢測

蔡艷霞蔡川川樊翌明張錫寶

·短篇論著·

尋常型銀屑病皮損中血管緊張素II及血管緊張素轉化酶的檢測

蔡艷霞1蔡川川1樊翌明1張錫寶2

目的: 檢測尋常型銀屑病皮損中血管緊張素II(AngII)及血管緊張素轉化酶(ACE)的水平變化。方法: 應用熒光定量聚合酶鏈反應(FQ－PCR)和免疫組化技術檢測30例尋常型銀屑病患者(進行期17例,靜止期13例)皮損Ang II和ACEmRNA及蛋白質的表達。結果: 銀屑病患者皮損中Ang II和ACE mRNA及蛋白質的表達明顯高于正常人對照組(P＜0.001),且進行期高于靜止期(P＜0.001)。結論: Ang II和ACE在銀屑病皮損中表達上調,推測可能與銀屑病皮損中新血管的形成有關。

銀屑病； 血管緊張素II； 血管緊張素轉化酶

銀屑病是一種常見的慢性易復發炎癥性皮膚病,新生血管形成是銀屑病重要的病理特征之一。1近年有學者對腎素－血管緊張素系統(rennin－angiotensin system,RAS)在皮膚組織的表達進行了研究,Ang II可促進血管內皮生長因子VEGF表達,進而導致新生血管形成、血管通透性增加,曾有報道使用血管緊張素受體拮抗劑及血管緊張素轉化酶抑制劑可誘發或加重銀屑病病情。2,3本研究通過檢測尋常型銀屑病患者皮損中Ang II和ACE mRNA和蛋白質的表達水平,進而明確兩者與尋常型銀屑病發病的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 研究病例 2009年1～9月在我院門診及廣州市皮膚病防治所就診的尋常型銀屑病患者30例,均經臨床與組織病理檢查確診,其中男18例,女12例,年齡16～73歲,平均39歲,病程1個月～10余年。銀屑病患者的皮損面積和嚴重程度按PASI評分為4.2～33.7分,平均13.45±6.42分。所有銀屑病患者近3個月內未系統服用維A酸﹑糖皮質激素﹑免疫抑制劑等藥物,2周內未使用任何外用藥物。

1.1.2 標本收集 所有患者常規皮損活檢,取材部位為腰背部及四肢。對照組15個標本來源于我院整形外科門診手術,其中男8名,女7名,年齡與銀屑病患者組相當,均排除銀屑病且無系統性疾病和其他皮膚病。

1.2 檢測方法

1.2.1 熒光定量PCR(FQ－PCR) 應用FQ－PCR檢測30例尋常型銀屑病患者皮損(進行期17例,靜止期13例)和15名正常人皮膚中Ang II、ACE mRNA的表達情況。

1.2.1.1 FQ－PCR引物探針設計 序列如下Sequence Name:H－Ang II(77 bp)；Forward Primer:5'－GCCACTATGGGCTGTCTACACA－3'；Reverse Primer:5'－TGGCTGAAGCAATCTTACATAGGT－3'；Probe:5'－FAM－TATGGAATACCGCTGGCCCTTTGGC－TAMRA－3'；Sequence Name:H－ACE(68 bp)；Forward Primer:5'－CCGAAATACGTGGAACTCATCAA－3'；Reverse Primer:5'－CACGAGTCCCCTGCATCTACA－3'；Probe:5'－FAM－CAGGCTGCCCGGCTCAATGG－TAMRA－3'。

1.2.1.2 組織RNA的提取 組織塊置勻漿器,加TRIZol(Invitrogen公司)1 mL,冷凍勻漿,依據說明書上的步驟提取RNA。

1.2.1.3 RNA樣品鑒定 濃度計算:每樣品在紫外分光光度計(日本SHIMADZU UV mini 1240)上測定波長為260 nm時的吸光度值。濃度計算公式:濃度(g/ L)＝OD260×稀釋倍數(120倍)×40/1000。

1.2.1.4 逆轉錄反應 取4μLRNA模板進行逆轉錄反應,儀器為PE9700PCR儀(美國Perkin Elmer公司),反應體系如下:5×逆轉錄buffer 4μL；上游引物(10 pM/μL)0.4μL；下游引物(10 pM/μL)0.4μL；dNTPs(25 mM)0.2μL；MMLV(10 U/μL)1μL；DEPC水10μL；RNA模板4μL；總體積:20μL；(逆轉錄buffer成分:50 mM Tris－HCl(pH 8.0),50 mM KCl,4 mM MgCl2,10 mM DTT)。反應條件:37℃1 h,95℃3 min。

1.2.1.5 熒光定量PCR反應 樣本按以下反應體系進行:5×定量PCR buffer(美國ABI公司)10μL；上游引物F(10 pM/μL)1μL；下游引物R(10 pM/μL)1 μL；dNTPs(25 mM)(Sigma公司)0.5μL；熒光探針(10 pM/μL)1μL；Taq酶(美國ABI公司)1.5μL；cDNA 5μL；ddH2O 30μL；總體積:50μL。

PCR buffer成分:10 mM Tris－HCl(pH 8.0),50 mM KCl,2mM MgCl2；反應條件為:93℃2 min,93℃45 s,55℃45 s,共40循環。

1.2.2 免疫組化SABC法檢測Ang II、ACE蛋白的表達情況 倒置OLYPUS顯微鏡攝像:應用KONTRON IBAS 2.5(德國)全自動圖像分析系統,參照文獻4所提供的免疫組化的定量方法,應用ZEISS Axiotron研究型顯微鏡,每張切片選取5個具有代表性的100倍視野,測出測試區域A的灰度級GA和面積(m＋n)及陽性反應產物α相的灰度Gα和面積n。計算各視野陽性指數(positive unit,PU),PU＝100×｜Gα－GA｜/〔(1－AAa)Gmax〕,其中Gmax為圖像分析系統的最大灰度級(其值為256),以平均值作為該標本的陽性系數值進行分析。

1.3 統計學方法 所得數據用(ˉx±s)表示,應用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學分析。統計學方法包括t檢驗、t'檢驗和直線相關分析,組間比較均先進行正態性檢驗,若資料不符合正態分布,則應用非參數檢驗,求相關系數(r)并作顯著性檢驗。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 銀屑病患者皮損細胞內Ang IImRNA的表達水平明顯高于正常對照者中的表達水平(P＝0.002),見表1。

2.2銀屑病患者皮損細胞內ACE mRNA的表達水平明顯高于正常對照者中的表達水平(P＝0.002),見表2。

2.3 Ang II蛋白及ACE蛋白在銀屑病皮損及正常對照組皮膚中的表達 尋常型銀屑病患者皮損中Ang II及ACE蛋白含量較對照組明顯增高(P＜0.001)；進行期與靜止期患者皮損的Ang II及ACE蛋白表達差異有顯著性(P＜0.001),見表3。

表1 銀屑病皮損和正常人皮膚內Ang IImRNA的表達

表2 銀屑病皮損和正常人皮膚內ACE mRNA的表達

表3 Ang II、ACE蛋白在銀屑病各組和正常組中的表達

3 討論

近年來有報道Ang II及ACE與銀屑病的發病有關,5在人表皮細胞(角質形成細胞、黑素細胞、表皮成纖維細胞和表皮血管內皮細胞)均有Ang II受體的表達,Ang II對各種表皮細胞的增殖和分化起重要作用。6本研究發現在銀屑病患者皮損血管內皮細胞和角質形成細胞中均表達Ang II,尤其是基底層及棘細胞層高度表達,表達量高于正常人。目前認為Ang II通過促進VEGF、內皮素－1、前列腺素D2等分子的表達而增加血管通透性,引起內皮細胞增殖并有新血管形成,從而誘發或加重銀屑病。2,3至于Ang II及VEGF在銀屑病中表達量的相關性及與其他致炎因子之間的相互作用有待進一步研究。本次實驗表明,銀屑病患者皮損中的ACE表達顯著高于正常人,且進行期和靜止期表達量差異有顯著性,表明ACE與銀屑病病情輕重程度具有相關性。ACE是皮膚炎癥如銀屑病或過敏性皮炎的重要監控因子,7能有效控制皮膚感覺神經末稍釋放的神經肽,并清除這些神經肽類物質和生長因子的蛋白裂解產物,銀屑病皮損區神經支配密度高于非皮損區及正常對照,且神經纖維顯著增長,P物質含量顯著增高。8進而誘導致炎因子的釋放,ACE作為這些致炎因子及神經肽類物質的監控因子,其水平隨之也增高。

1 Creamer JD,Barker JN.Vascular proliferation and angiogenic factors in psoriasis.Clin Exp Dermatol,1995,20(1):6－9.

2 Antonor D,Grozdev I,Pehlivanov G,et al.Psoriatic erythroderma associated with enalapril.Skinmed,2006,5(2):90－92.

3 Cohen AD,Bonneh DY,Reuveni H,et al.Drug exposure and psoriasis vulgaris:case－control and case－crossover studies.Acta Derm Venereol,2005,85(4):299－303.

4申洪.免疫組織化學染色定量方法研究(III).中國組織化學與細胞化學雜志,1995,4(1):89－91.

5Cambien F,Alhence－Gelas F,Herbeth B,et al.Familial resemblance of plasma angiotensin－converting enzyme level:the Nancy Study.Am JHum Genet,1998,43(5):774.

6 Das UN.Is angiotensin－IIan endogenous pro－inflammatorymolecule.Med SciMonit,2005,11(5):155－162.

7 Scholzen TE,Luger TA.Neutral endopeptidase and angiotensinconverting enzyme－key enzymes terminating the action of neuroendocrinemediators.Exp Dermatol,2004,13(Suppl,4):22－26.

8Eedy DJ,Johnston CF,Shaw C,etal.Neuropeptides in psoriasis:an immunocytochemical and radioimmunoassay study.Invest Dermatol,1991,96(4):43－48.

(收稿:2012－10－31 修回:2013－04－15)

The expression of angiotensin II and angiotensin converting enzyme in patien tsw ith psoriasis

CAIYan-xia,CAIChuan-chuan,Fan Yi-ming,et al.Guangdong Medical College Affiliated Hospital,Guangdong,Zhanjiang,524001

Objective:To detect the level of angiotensin II(Ang II)and angiotensin converting enzyme (ACE)in patientswith psoriasisvulgaris.Methods:The levelof Ang IIand ACEwas detected by fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ－PCR)and immunohistochemistry technique in 30 patients with psoriasis vulgaris(progressing stage in 17 cases and stable stage in 13)and 15 normal controls.Results:The level of Ang IIand ACE protein was significantly higher in psoriatic lesions than in controls(P＜0.001)and in progressing stage higher than in stable stage(P＜0.001).Conclusion:Over expression of Ang IIand ACE in psoriatic lesionsmay be implicated in the neovascularization of psoriasis.

psoriasis；angiotensin II；angiotensin converting enzyme

1廣東醫學院附屬醫院皮膚科,廣東湛江,524001

2廣州市皮膚病防治所,廣東廣州,510095