腫瘤相關M2型巨噬細胞通過Toll樣受體增強卵巢癌細胞MMP-9的表達

柯 星，張淑平，吳 夢，黃 蕾，孫瑞紅，黃珮珺，潘世揚，王 芳

(南京醫科大學第一附屬醫院檢驗學部國家臨床檢驗重點專科建設單位，江蘇南京210029)

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是最常見的女性惡性腫瘤之一，發現時常已發生侵襲轉移。而基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)作為一類Zn2+依賴的細胞外蛋白水解酶，它可以降解基底膜，有促進腫瘤細胞侵襲和轉移的功能。近年來研究認為，MMP-9(明膠酶B/92 kDa Ⅳ型膠原酶)在多種腫瘤的發生發展，尤其是在卵巢癌細胞的侵襲轉移中起重要作用［1］。已有報道認為內外源性配體可識別和激活模式分子受體——Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)，進一步活化多種信號傳導途徑，從而最終介導MMPs 的表達［2］。而腫瘤微環境中的巨噬細胞可受腫瘤因素誘導分化，成為M2型巨噬細胞，即腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophage，TAMs)，促進腫瘤發生和演進［3］。但卵巢癌微環境中的M2 型巨噬細胞對卵巢癌細胞侵襲和轉移的作用和機制目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細胞系SKOV3、單核巨噬細胞系THP-1(中國科學院細胞庫);RPMI 1640 培養基、McCoy's 5A 培養基、胎牛血清(Hyclone 公司);FITC 標記小鼠抗人CD206 抗體(BD 公司);兔抗人MMP-9 抗體和兔抗人MyD88 抗體(Cell signaling 公司);Toll 受體激動劑(San Diego 公司);SYBR? Premix Dimer-EraserTM(TaKaRa 公司)。

1.2 細胞培養

將THP-1 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基中，SKOV3 細胞置于含10%胎牛血清的McCoy's 5A 中于37 ℃、5% CO2條件培養，THP-1細胞為懸浮增殖，SKOV3 細胞為貼壁增殖，SKOV3 細胞80%匯合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數增殖期的細胞用于實驗。

1.3 M2 型巨噬細胞的極化

含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養基重懸THP-1 細胞至1 ×109個/L，加入佛波醇酯，調整濃度為320 nmol/L，刺激24 h 后，棄上清，PBS 充分洗滌，倒置顯微鏡形態學拍片，并進行后續的直接免疫熒光或共培養實驗。

1.4 直接免疫熒光

蓋玻片預先鋪在6 孔板內，PMA 處理后THP-1細胞，4%多聚甲醛固定20 min，隨后0.5% Triton X-100 透膜15 min，1% BSA 37 ℃封閉30 min，每孔按1 ∶300 加入FITC 標記小鼠抗人CD206 抗體。37 ℃避光孵育2 h，PBS 漂洗3 次。抗熒光淬滅劑封片后，小心將片子夾出，倒扣于載玻片上，倒置熒光顯微鏡觀察并攝圖。

1.5 建立共培養實驗體系

M2 型巨噬細胞(1 ×106個/孔)生長于6 孔細胞培養板外室，SKOV3(5 ×105個/孔)生長于6 孔細胞培養板內室(0.4 μm 微孔)，同時設置內室為SKOV3(5 ×105個/孔)外室無M2 型巨噬細胞為對照組。每組設立3 復孔，37 ℃、5% CO2培養24 和48 h。

1.6 TLRs 激動劑刺激細胞

將SKOV3 以1 × 105個/孔培養于96 孔板，100 μL/孔，分別加入TLR1 激動劑Pam3CSK4(終濃度為1 mg/L)、TLR2 激動劑HKLM(終濃度為1011個/L)、TLR6 激動劑FSL-1(終濃度為1 mg/L)。同時設立單獨SKOV3 培養無TLRs 激動劑孔為對照組，每組均設6 個復孔，37 ℃、5% CO2培養6、12和24 h。

1.7 RNA 提取及RT-PCR

以β-actin 為內參照，進行TLR1、TLR2、TLR6和MMP-9 實時熒光定量PCR 檢測(ABI 7500 型)。TLR1 上游引物序列5'-GGAGGCAATGCTGCTGTT-3'，下游引物序列5'-GCCCAATATGCCTTTGTTATC CTG-3';TLR2 上游序列5'-TGTTGCAAGCAGGATCC AAAG-3'，下游序列5'-CACAAAGTATGTGGGCATTG TCCAG-3';TLR6 上游序列5'-CAGAGTGAGTGGTGC CATTACGA-3'，下游序列5'-AGCCTTCAGCTTGTGG TACTTGTTG-3';MMP-9 上游序列5'-GCTCTTCCCTG GAGACCTGA-3'，下游序列5'-CTGCCTAACCCTGG ACACCT-3';β-actin 上游序列5'-TGGCCCCAGCACA ATGAA-3'，下游序列5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTA GAAGCA-3'。PCR 反應體系和擴增程序按照說明書。根據PCR 所得CT 值應用2-△△CT法計算TLR1、2、6 和MMP-9 相對表達量。

1.8 Western blot

Transwell 小室中共培養過程后收集各組細胞，用BCA 法進行蛋白質定量。取30 μg 蛋白質/泳道加入5 ×SDS 凝膠加樣緩沖液。以80 V 濃縮膠和120 V 分離膠電泳分離細胞蛋白質，轉膜1 h 50 min。室溫封閉2 h 后，4 ℃搖床一抗孵育過夜;TBST 洗膜10 min×3 次;搖床上二抗室溫孵育2 h;TBST 洗膜10 min×3 次。用DAB-HRP 熒光檢測試劑激發熒光，GAPDH 蛋白為內參照，于暗室顯影和定影后進行圖像分析。

1.9 統計學分析

采用SPSS16.0 進行分析。正態分布數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗。

2 結果

2.1 PMA 刺激前后THP-1 形態變化

通常未經誘導的THP-1 細胞多呈懸浮生長，多為圓形。圖1 顯示在320 nmol/L PMA 誘導分化12和24 h 后，細胞形態變為多邊形，細胞表面可伸出偽足，胞質內偶見空泡，細胞體積明顯增大，24 h 較12 h的刺激時間，THP-1 的極化現象更加明顯。

圖1 PMA 刺激后THP-1 形態變化Fig 1 THP-1 morphological changes after PMA stimulation (×200)

2.2 THP-1 誘導分化后表面分子標志的改變

PMA 誘導后細胞膜表面有較高的熒光強度，CD206 表達陽性(圖2A，B)，認為THP-1 細胞向M2型巨噬細胞方向分化。而未經PMA 誘導的THP-1細胞表面CD206 無表達或低表達(圖2C，D)。

圖2 THP-1 誘導分化后直接免疫熒光表面CD206 的表達Fig 2 Detecting CD206 expression by direct immunofluorescence (×200)

2.3 共培養體系對SKOV3 中MMP-9 表達水平影響

與M2 型巨噬細胞共培養24 和48 h 的SKOV3中MMP-9 mRNA 水平明顯高于SKOV3 單獨培養組(P＜0.05)(圖3)。24 和48 h 共培養組中SKOV3的MMP-9 蛋白表達水平較SKOV3 單獨培養組也明顯提高(圖4)。

圖3 共培養體系對SKOV3 中MMP-9 mRNA表達水平影響Fig 3 Level changes of MMP-9 mRNA in co-culture system

圖4 共培養體系對SKOV3 中MMP-9 蛋白水平的影響Fig 4 Level changes of MMP-9 protein in co-culture system

2.4 共培養體系對SKOV3 中TLRs 表達水平影響

共培養24 h 后，TLR1、TLR2 和TLR6 mRNA 表達水平顯著高于SKOV3 單獨培養組(P＜0.05)(圖5A)，而共培養48 h 后，共培養組中SKOV3 的TLR1、TLR2 和TLR6 mRNA 表達水平也高于SKOV3 單獨培養組(P＜0.05)(圖5B)。

2.5 共培養體系對SKOV3 中TLRs 信號通路蛋白表達影響

與M2 型巨噬細胞共培養24 和48 h 的SKOV3中TLRs 信號通路蛋白MyD88、TRAF6 和P-NF-κB表達水平顯著高于SKOV3 單獨培養組(圖6)。

2.6 TLRs 刺激SKOV3 對MMP-9 的影響

圖7 顯示Pam3CSK4 刺激SKOV3 6 h 后，MMP-9 mRNA 水平開始升高，12 和24 h 表達高于SKOV3 單獨培養組(P＜0.05);然而HKLM 刺激6 h 后，MMP-9 mRNA 水平升高不明顯，但12 和24 h MMP-9 較SKOV3單獨培養組升高(P＜0.05);FSL-1 刺激6、12 和24 h 后，MMP-9 mRNA 水平高于SKOV3 單獨培養組(P＜0.05)。

圖5 共培養體系對SKOV3 中TLRs 表達水平的影響Fig 5 Level changes of TLRs mRNA in co-culture system

圖6 共培養體系對SKOV3 中TLRs 信號通路蛋白表達的影響Fig 6 Level changes of TLRs signaling pathway proteins in co-culture system

3 討論

卵巢癌(OC)是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，發病隱匿，70%～80%患者確診時已到晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)［4］。基質金屬蛋白酶(MMPs)是能夠降解基底膜和細胞外基質的主要成分，而MMP-9主要降解細胞外基質中Ⅳ型膠原，從而破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，促進細胞轉移［5-6］。已有文獻明確報道，MMP-9 表達升高與卵巢癌惡性程度呈相關性［7］。

圖7 TLR1、2、6 激動劑作用SKOV3 對MMP-9 的影響Fig 7 Effects of TLR1，2 and 6 agonist to MMP-9 mRNA in SKOV3

近十多年來，發現巨噬細胞在各種刺激劑的作用下，可具有不同的活化狀態，并在不同的微環境中發揮不同的作用［8］。多位學者認為在腫瘤內巨噬細胞有向M2 型轉化的趨勢，即腫瘤相關巨噬細胞(TAM)，能表達高水平的CD206 和IL-10，可抑制T 細胞增殖，參與了腫瘤的進展過程。認為M2 型巨噬細胞對卵巢癌內皮細胞血管生成及腫瘤進展發揮作用［9］。但M2 型巨噬細胞對卵巢癌侵襲轉移的作用及具體機制并不清楚。

本實驗建立M2 型巨噬細胞和卵巢癌細胞系SKOV3 的共培養系統，24 和48 h 后發現SKOV3 中MMP-9 表達水平明顯高于SKOV3 單獨培養組。提示M2 型巨噬細胞在卵巢癌生長微環境中可誘導上調MMP-9 的表達，增強卵巢癌的侵襲和轉移。M2型巨噬細胞上調MMP-9 的機制如何?TLRs 是否可能參與這一過程?TLRs 是近年研究較多的跨膜模式識別受體，不僅表達于免疫細胞［10］，在人類腫瘤及腫瘤細胞系同樣有表達，可能參與腫瘤的發展演進過程［11］。TLR1、TLR2 和TLR6 是介導炎性反應的主要受體，TLRs 活化后，在MyD88 依賴性信號途徑中，可使IRAK 發生磷酸化改變，進一步促使TRAF6 寡聚化。由活化后的TRAF6 和TAK1 介導活化IKKs，引起IκB 降解，導致NF-κB 亞單位的釋放并轉移至核內啟動各種基因轉錄［12］。近來發現TLRs 與腫瘤發展的行為學密切相關。本研究結果顯示共培養后的SKOV3 可高表達TLR1、2 和6，TLRs 信號通路蛋白MyD88、TRAF6 和P-NF-κB 表達水平也明顯提高，提示M2 型巨噬細胞的共培養環境中，某些因素可活化卵巢癌細胞TLRs。國外也有類似研究，結腸癌TLR9 可以通過激活NF-κB 通路來促進直腸癌細胞LS174 和SW620 發生侵襲［13］，在黑色素瘤細胞的侵襲轉移是與細胞內TLR4 的活化和NF-κB 通路介導［14］。提示TLRs 在腫瘤細胞上的高表達和活化，可能發揮了一定生物學功能。

為了探究TLRs 信號通路活化與MMP-9 表達的關系，發現使用TLR1、2 和6 相應激動劑作用后的SKOV3 表現出MMP-9 的表達增強，而TLR1、2 和6通路活化與MMP-9 表達上調有關，此結果從側面提示M2 型巨噬細胞可以刺激和活化卵巢癌細胞的TLR1、TLR2 和TLR6 信號通路，使得基質金屬蛋白酶MMP-9 表達增高，MMP-9 可降解、破壞靠近腫瘤表面的細胞外基質，促進卵巢癌侵襲轉移的過程。但其具體的作用機制有待進一步探索。

綜上所述，本研究發現M2 型巨噬細胞可通過某種機制，刺激卵巢癌細胞TLR1、TLR2 和TLR6表達上調，使TLRs 信號通路活化，進一步促使MMP-9 表達增加，可能與卵巢癌侵襲生長的生物學行為有關。M2 型巨噬細胞及TLRs 介導的信號傳導通路在卵巢癌發生、發展中的作用，能為TAM與卵巢癌及其相互關系的發病機制研究提供了新的思路。

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