Notch和HES蛋白表達在大鼠靜脈橋狹窄中的作用

魏小棟，肖永光

(1.湖北民族學院附屬民大醫院心胸外科，湖北恩施445000;2.武漢大學人民醫院胸外科，湖北武漢430062)

自體靜脈因其取材方便、操作相對簡單，常作為外科治療冠心病和外周動脈狹窄的首選材料。但此類手術后靜脈橋遠期療效不佳，5年通暢率僅為30%，導致遠端血供重新受到影響，嚴重者甚至需要再次手術治療［1］。研究表明，影響術后靜脈橋再次狹窄的主要原因是中層血管平滑肌細胞的大量增生并分泌大量的細胞基質在管壁堆積，造成管壁增厚、彈性減弱［2］。但血管平滑肌細胞增生和分泌大量細胞基質的病理機制目前卻尚不清楚［3］。

Notch 是一個非常保守的信號通路，其一共有4個受體(Notch1、2、3、4)和5 個配體(Jagged1、2 和Dll1、3、4)，γ-促分泌酶復合體DAPT 酶切釋放Notch 受體的活化形式NICD 和HES1。有研究表明Notch 通路在血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，vSMCs)的增生/凋亡以及細胞表型變化過程中起到重要作用［4］。但Notch 信號在靜脈橋狹窄中的作用目前尚不清楚，本研究探討Notch 信號在靜脈橋狹窄中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗模型的建立與分組

SPA 級SD 大鼠，體質量220～240 g，雌雄不限。共30 只(武漢大學實驗中心)，隨機分為對照組(control)、實驗組和安慰劑組，每組10 只。各組實驗動物均建立靜脈橋移植模型，從尾靜脈注射4%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)+肝素(1.5 mg/kg)。麻醉誘導成功后，左頸部備皮并切開頸部皮膚，游離左側頸總動脈和頸外靜脈。在25 倍手術顯微鏡下，剪取長約1 cm 靜脈作為血管橋，用11-0 醫用無損傷線將動脈兩端分別與靜脈橋行端端吻合［5］。術畢依層縫合，關閉切口。術后置大鼠于室溫，自然清醒。術畢每日觸摸頸部，靜脈橋處可及震顫。對照組術后不做任何處理;實驗組(DAPT 組)每只每日皮下注射DAPT 10 mg/kg;安慰劑組(DMSO 組)注射安慰劑二甲基亞砜(DMSO)10 mg/kg。術后3 組動物均常規飼養。實驗所有試劑均來自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 標本采集和處理

術后組動物常規飼養，手術當天及術后第7、14、21 及28 天隨機抽取3 組動物各2 只，用上述相同方法麻醉后沿原切口切開，游離靜脈橋，清除靜脈壁外附著組織，阻斷兩端吻合處，向腔內注入適量10%甲醛液，10 min 后切取移植靜脈橋進行常規病理切片，HE 染色及PCNA 免疫組化染色。實驗動物均放血處死。

1.3 觀察指標

術后28d 收集齊各組移植靜脈后觀察以下指標:在顯微鏡下，以內彈力膜為界，測量10 mm 長靜脈橋中膜平均厚度;計算靜脈橋中膜平滑肌細胞系PCNA 染色陽性指數(PCNA 指數= PCNA 陽性細胞/視野下100 個細胞×100%);取移植血管，裂解細胞制成蛋白液后，行Western blot，分析Notch1 和HES1 的蛋白濃度變化。

1.4 統計學分析

采用spss17.0 軟件進行統計分析。定量數據用均數±標準差(±s)表示，組間比較用t 檢驗。

2 結果

2.1 Notch 信號蛋白在靜脈橋中呈高表達狀態

Notch1，HES1 蛋白在靜脈移植中呈高表達，且隨著時間的延長，這些蛋白表達逐漸增加(圖1)。HES1 蛋白的表達與靜脈狹窄的嚴重程度呈正相關(圖2)。

圖1 WB 顯示相關蛋白表達變化Fig 1 WB data show the result of Notch1 and HES1

圖2 HES1 蛋白表達與移植靜脈中膜厚度相關性Fig 2 The expression of HES1 protein and intima thickness of vein graft

2.2 抑制Notch 信號能夠緩解靜脈橋狹窄

DAPT 能夠明顯抑制HES1 蛋白的表達(圖3)，而安慰劑組中DMSO 對Notch 信號通路無影響，所以HES1 蛋白表達無變化。圖4 顯示各組移植靜脈后靜脈管壁厚度的差異。圖5 顯示DAPT 組中層厚度比例明顯低于對照組和DMSO 組(P＜0.05)，PCNA 指數顯示DAPT 組明顯低于其他兩組(P＜0.05)(圖6)。

圖3 各組移植靜脈vSMCs 中HES1 蛋白表達Fig 3 The expression of HES1 protein in each group

圖4 各組移植靜脈HE 染色Fig 4 H＆E staining in each group

圖5 各組移植靜脈中膜厚度比變化Fig 5 The intima thickness of vein graft in each group

3 討論

靜脈是用于治療冠心病和外周動脈狹窄最常用的自體材料，但靜脈橋再狹窄一直是制約其遠期療效的關鍵因素［6］。雖然靜脈橋狹窄的原因目前尚未完全明了，有研究表明靜脈橋發生狹窄的主要原因是血管壁中膜平滑肌樣細胞增生且細胞表型發生變化，并分泌大量細胞外基質在血管壁內堆積，從而形成移植橋血管管腔狹窄，導致閉塞［5］。本實驗也證實如果降低中膜平滑肌細胞的增殖能力，可以極大限度的緩解靜脈橋狹窄的程度。

圖6 各組移植靜脈PCNA 指數變化Fig 6 PCNA positive index of vein graft in each group

Notch 信號是一個相對保守的通路，其在血管系統的生理和病理反應中均起到重要作用，特別是在調控血管平滑肌細胞增生方面起到重要作用［3，7］。本實驗證實靜脈橋狹窄過程中，Notch 信號通路明顯活化，其蛋白成員均呈高表達狀態，且與靜脈橋狹窄程度呈正相關，這說明Notch 信號與靜脈橋狹窄存在一定的相關性。而通過DAPT 阻斷Notch 信號通路，不僅可以使Notch 信號通路的蛋白表達下降，而且可以明顯抑制肺動脈高壓的形成。本實驗結果還顯示血管平滑肌細胞PCNA 陽性指數明顯降低，提示血管平滑肌細胞增生程度明顯被抑制，表明DAPT 能夠通過阻斷notch 通路，影響血管平滑肌細胞的增生，從而達到抑制靜脈橋內膜增厚的目的［8］。

［1］Hillis LD，Smith PK，Anderson JL，et al.2011 ACCF/AHA Guideline for coronary artery bypass graft surgery:executive summary:a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines［J］.Circulation，2011，124:2610-2642.

［2］Serruys PW，Morice MC，Kappetein AP，et al.Percutaneous coronary intervention versus coronary-artery bypass grafting for severe coronary artery disease［J］.N Engl J Med，2009，360:961-972.

［3］Kudo FA，Muto A，Maloney SP，et al.Venous identity is lost but arterial identity is not gained during vein graft adaptation［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27:1562-1571.

［4］Chen Y，Zheng S，Qi D，et al.Inhibition of Notch signaling by a c-secretase inhibitor attenuates hepatic fibrosis in rats［J］.PloS One，2012，7:e46512

［5］Sun J，Zheng J，Ling KH，et al.Preventing intimal thickening of vein grafts in vein artery bypass using STAT-3 siRNA［J］.J Transl Med，2012，10:2-3.

［6］Bikdeli B，Hassantash SA，Pourabdollah M，et al.Histopathologic insight into saphenous vein bypassgraft disease［J］.Cardiology，2012，123:208-215.

［7］Muto A，Model L，Ziegler K，et al.Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation:insights into the neointimal algorithm and management strategies［J］.Circ J，2010，74:1501-1512.

［8］Lyon CA，Koutsouki E，Aguilera CM，et al.Inhibition of N-cadherin retards smooth muscle cell migration and intimal thickening via induction of apoptosis［J］.J Vasc Surg，2010，52:1301-1309.