VEGF通過上調CCN2促HUVEC遷移和血管生成

曹玉凈，呂秋霞

(河南省中醫院1.創傷骨科;2.風濕骨病科，河南鄭州450002)

骨折修復過程與機體多種細胞因子及組織之間協同作用密切相關。血管生成與骨生成關系緊密相連，尤其在骨修復過程中尤為重要［1］。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促進血管生成的直接誘導因子，可出現于骨折愈合過程，特異性作用于內皮細胞，促進其增殖和血管生成，并可增加血管通透性［2］。結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF/CCN2)屬CCN 家族，能促進內皮細胞、成纖維細胞及平滑肌細胞分裂，參與血管生成和創傷愈合等重要過程［3］，但在骨形成和骨折愈合中作用尚不清楚。本實驗探討VEGF 誘導的成骨細胞中CCN2 對人臍靜脈血管內皮細胞的影響，為骨形成和骨折愈合的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)(Promocell公司)，人成骨細胞(osteoblast)(天津衛凱生物工程有限公司)，由本實驗室保存。DMEM 培養基、胎牛血清和DMSO(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)，ELISA 試劑盒(Bio Tek 公司)，CCN2 抗體和對照抗體IgG(Santa Cruz 公司);VEGF165 (Abnova 公司)。

1.2 成骨細胞上清液的制備

成骨細胞接種至6 孔板中，PBS 洗滌1 次，換成不含血清的DMEM 培養12 h。PBS 洗滌，加入含有0.2%胎牛血清的DMEM，20 ng/mL VEGF 刺激，1 h后，更換含有0.2%胎牛血清DMEM。培養6 h 后收集細胞上層清液用于遷移實驗和血管生成實驗。同時制備未加VEGF 刺激的成骨細胞作為對照組。

1.3 CCN2 基因siRNA 序列的設計及轉染成骨細胞

siRNA 片段由上海生工合成。靶向CCN2 的siRNA 序列為5'-AATGTTCTCTTCCAGGTCAGCCCT GTCTC-3'(正義鏈)和5'-AAGCTGACCTGGAAGA GAACACCTGTCTC-3'(反義鏈)。制備終濃度為80 nmol/L的siRNA-脂質體復合物，實驗組加入CCN2-siRNA 混合物，同時設置空白對照組(control)。將人成骨細胞以2 ×105個/孔接種于6 孔板，待細胞增殖至70%～80%匯合時，更換無血清培養基，采用LipofetamineTM2000 將CCN2-siRNA 轉染成骨細胞，每組實驗重復3 次。

1.4 Real time PCR 法檢測成骨細胞CCN2 mRNA 的表達

用RNAiso plus kit 試劑盒提取細胞總RNA，按照試劑盒要求操作。CCN2 上游引物序列:5'-GC AGGCTAGAGAAGCAGAGC-3'，下游引物序列:5'-AT GTCTTCATGCTGGTGCAG-3'［4］，檢測按實驗室常規方法進行PCR 擴增。定量PCR 采用的體系為:dNTPs 2 μL，10 ×緩沖液5 μL，上下游引物各10 皮摩爾，模板2 μL，加三蒸水至總體積50 μL;擴增條件為:預變性94 ℃5 min，進入循環，變性94 ℃1 min，退火60 ℃1 min，延伸72 ℃3 min，30 個循環后，72 ℃延伸5 min。以β-actin 為內參，依據2-ΔΔCT法分析相對基因表達水平，上述實驗重復3 次。

1.5 酶聯免疫吸附實驗檢測成骨細胞CCN2 含量

酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測成骨細胞CCN2的含量，按說明書嚴格操作，每個實驗重復3 次。

1.6 Transwell 法檢測細胞遷移

參照文獻［5］方法進行，取直徑為6.5 mm、孔徑為8.0 μm 的聚碳酯膜分離上、下兩室的24 孔Transwell小室。實驗前，聚碳酯膜上涂有PBS(含有10 μg/mL 纖連蛋白)4 ℃放置16 h。消化內皮細胞，終止消化后離心棄去培養液，(用PBS 洗1～2遍)，用含2%胎牛血清的DHEM 培養基重懸，調整細胞濃度至1 ×106/mL。取細胞懸液100 μL 加入Transwell 小室，相應的刺激因素加入到下室，各設4個復孔。37 ℃培養6 h 后，顯微鏡下計數。

1.7 Matrigel 實驗檢測管樣結構的形成能力

每孔100 μL 基質膠均勻鋪于48 孔培養板的底部，靜置于37 ℃孵箱1 h，使基質膠凝固。消化、離心和重懸對數增殖期細胞，使重懸后的細胞濃度為5 ×105個/mL，細胞懸液以100 μL/孔加入基質膠已凝固的48 孔培養板中，將100 μL 含有無血清DMEM 加到對照組，實驗組加入相應的成骨細胞上清液，每組設3 個復孔。48 h 于倒置顯微鏡下觀察是否有管樣結構形成，并測量已形成的管樣結構長度，上述實驗重復3 次。

1.8 統計學分析

所得數據用SPSS16.0 統計軟件進行統計學分析，試驗結果用均值±標準偏差(±s)表示，采用t檢驗進行統計學分析。

2 結果

2.1 VEGF 增加成骨細胞中CCN2 mRNA 的表達

VEGF 刺激12 h 后，成骨細胞中CCN2 mNRA 表達及蛋白含量均上調(P＜0.05，圖1)。VEGF 呈時間和劑量依賴性上調成骨細胞中CCN2 表達(圖2)。

圖1 VEGF 作用12 h 后誘導成骨細胞中CCN2 的表達Fig 1 After treatment for 12 hours，VEGF induces the expression of CCN2 in osteoblasts(±s，n=3)

圖2 VEGF 呈劑量和時間依賴性誘導CCN2 mRNA 表達Fig 2 VEGF induces CCN2 expression in a dose-and time-dependent manner(n=3)

2.2 成骨細胞產生的CCN2 可促進內皮細胞遷移

PC 組與正常對照組相比對內皮細胞遷移有明顯的促進作用(P＜0.05)(圖3)。加入抗CCN2 后，遷移明顯降低(P＜0.05)(圖3)。

圖3 成骨細胞產生的CCN2 可促進內皮細胞的遷移Fig 3 Osteoblast-derived CCN2 promotes HUVEC migration (n=3)

與對照組相比，CCN2-siRNA 組CCN2 表達水平明顯下調(P＜0.05，圖4A)。沉默CCN2 后內皮細胞遷移情況(圖4B):VEGF-OSE 組:CCN2-siRNA 組內皮細胞遷移能力較con-siRNA 組和PC 組明顯降低(P＜0.05)。

2.3 成骨細胞中的CCN2 對內皮細胞體外成管的影響

VEGF-OSE 組:PC 組較正常對照組管樣長度明顯增加(P＜0.05)。VEGF-OSE 組，anti-CCN2 組較PC 組管樣長度明顯降低(P＜0.05)，con-IgG 組與PC 組比較無明顯差別。OSE 組，3 組內皮細胞管樣長度較正常對照組相比均無顯著變化(圖5)。

3 討論

血管生成(angiogenesis)是骨折修復過程中的重要因素，它不僅對骨折部位提供營養，而且參與了骨折的修復過程［6］。VEGF 是目前已知的血管生成的重要介質之一，它可誘導血管生成，促進骨折愈合［7］。VEGF 還通過與其他生長因子相互作用來影響骨生長和修復過程。CCN2 是細胞功能和血管生成的重要調節分子，它可以促進細胞的增殖、遷移、存活和黏附［8］。CCN2 還通過參與整合素αvβ3 介導的血管內皮細胞黏附、誘導血管生成、促進游走、提高生長因子誘導的細胞增殖［9］。CCN2 促進血管生成有利組織修復和骨折愈合。

本研究通過體外培養成骨細胞和HUVEC，觀察到VEGF 刺激成骨細胞后，CCN2 表達明顯上調;成骨細胞產生的CCN2 增強內皮細胞遷移和管樣結構形成等促血管生成能力。表明成骨細胞產生的CCN2 參與了內皮細胞遷移和管樣結構形成，提示成骨細胞產生的CCN2 在內皮細胞血管生成和骨折愈合中可能發揮重要作用。本文為骨血管形成中成骨細胞和內皮細胞的關系提供了一些依據，成骨細胞產生的CCN2 可以成為骨折愈合治療的一個新靶點。

圖4 CCN2-siRNA 對內皮細胞遷移的影響Fig 4 Effect of CCN2-siRNA on HUVEC migration(n=3)

圖5 成骨細胞產生的CCN2 對內皮細胞體外成管的影響Fig 5 Effect of osteoblast-derived CCN2 on capillary tube formation in vitro(n=3)

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