Bcl-2、Bax及caspase-9在鼻息肉組織中的表達變化

徐 芬，康 健，陳 冬，馬曉峰

(遼寧醫學院附屬第一醫院耳鼻喉科，遼寧錦州121001)

鼻息肉(nasal polyps，NPs)是耳鼻咽喉科的常見病及多發病，主要表現為鼻-鼻竇黏膜的慢性病變，組織病理學特點為高度水腫的鼻-鼻竇黏膜，黏膜下血管及間質增生，腺體分泌活躍及炎性細胞浸潤。至今鼻息肉的病因及發病機制尚不明確，相關研究認為鼻息肉的發生與感染、過敏、纖毛形態結構和功能異常、微環境的改變、嗜酸粒細胞及細胞因子的增生有關，其中細胞因子在鼻息肉發病機制中的作用越來越受到人們的關注，近年來的研究甚多，主要集中在促進細胞增殖的細胞因子，而細胞凋亡的研究相對較少，本研究通過研究3 種重要的細胞凋亡相關因子Bcl-2，Bax 及caspase-9，從基因和蛋白兩個水平來探討細胞凋亡在鼻息肉發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本采集:鼻息肉組織來源于遼寧醫學院附屬第一醫院2012年01月至2013年10月接受手術的鼻息肉患者共41 例，男24 例，女17 例。年齡31～77 歲，平均54 歲。下鼻甲黏膜組織來源于慢性鼻炎的患者共26 例，男17 例，女9 例。年齡22～68 歲，平均45 歲。所有患者在手術前均詳細了解病情，所取組織標本均經患者及家屬同意后簽署知情同意書。手術取下的新鮮標本部分立即投入－270 ℃的液氮中保存，留做RT-PCR 反應用，一部分用甲醛固定48 h，石蠟包埋，做4 μm 切片。

所有患者術前2 周內均未使用過皮質類固醇等藥物，變應原皮膚點刺和血清特異性IgE 檢查結果為陰性，1年內有鼻息肉手術及6 個月內有鼻竇急性反應或上呼吸道感染者被排除外。

1.2 方法

1.2.1 Real-time qRT-PCR:用Trizol 法提取總DNA，分光光度計測A260/A280的比值(平均＞1.8)，并定量。取0.5 μg 總RNA 按PrimeScript RT 反轉錄試劑盒說明反轉錄生成cDNA，以β-actin 為內參，使用ABI7900HT real time PCR 熒光定量PCR 儀，通過二步法SYBP Green 實時熒光定量PCR 技術擴增目的基因。PCR 擴增:第一步:95 ℃30 s，一個循環;第二步:95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環。每個標本均繪制熔解度曲線。使用公式y=2－ΔΔCt對目的基因進行相對定量。

1.2.2 免疫組化部分:石蠟切片用SP 法按照試劑盒說明分別進行Bcl-2，Bax 及caspase-9 免疫組化染色，以胞質中出現棕黃色顆粒的陽性反應產物。每張切片在高倍顯微鏡下(×400)隨機選擇5 個視野，取平均值作為該標本的陽性細胞率。每張切片均經2 位病理科醫師進行單盲法評估。

1.3 統計學分析:所有數據均用SPSS16.0 統計軟件處理。qRT-PCR 結果應用t 檢驗進行統計學分析，免疫組化結果應用χ2檢驗進行統計學分析。

2 結果

2.1 免疫組化:結果顯示鼻息肉中可見較多的Bcl-2 和Bax陽性細胞，大部分聚集在鼻息肉的上皮層及血管腺體周圍，而對照組中陽性表達較少，細胞核多呈藍色;而鼻息肉中caspase-9 表達為弱陽性，主要聚集在間質細胞中，而對照組中陽性細胞較多，明顯高于鼻息肉組(圖1，2，3)。

圖1 Bcl-2 蛋白在兩組中的表達Fig 1 The expression of Bcl-2 protein in two groups

2.2 鼻息肉組和對照組中Bcl-2、Bax、caspase-9 mRNA 的表達結果及免疫組化陽性率結果(表1，2)。

圖2 Bax 蛋白在兩組中的表達Fig 2 The expression of Bax protein in two groups

圖3 Caspase-9 蛋白在兩組中的表達Fig 3 The expression of caspase-9 protein in two groups

表1 鼻息肉組和對照組中Bcl-2、Bax、caspase-9 mRNA 的表達結果Table 1 The Bcl-2，Bax and caspase-9 mRNA expression level in different groups(±s，n=67)

表1 鼻息肉組和對照組中Bcl-2、Bax、caspase-9 mRNA 的表達結果Table 1 The Bcl-2，Bax and caspase-9 mRNA expression level in different groups(±s，n=67)

＊P＜0.05 compaired with control.

groupBcl-2Baxcaspase-9 control1.65 ±0.201.14 ±0.181.18 ±0.17 NPs4.02 ±0.62*1.94 ±0.38*0.84 ±0.06*

表2 鼻息肉組和對照組中Bcl-2、Bax、caspase-9免疫組化陽性率結果Table 2 The positive expression rate of Bcl-2，Bax，caspase-9 in different groups［±s(%)，n=67］

表2 鼻息肉組和對照組中Bcl-2、Bax、caspase-9免疫組化陽性率結果Table 2 The positive expression rate of Bcl-2，Bax，caspase-9 in different groups［±s(%)，n=67］

＊P ＜0.05 compaired with control．

groupBcl-2Baxcaspase-9 control38.46 ±1.2946.15 ±1.9142.31 ±1.20 NPs87.80 ±2.32*75.61 ±2.07*24.39 ±1.02*

2.3 Bcl-2 在鼻息肉中的表達與bax 表達的相關性:鼻息肉組織中Bcl-2 的表達與bax 的表達存在正相關趨勢(P＜0.05)。

3 討論

鼻息肉的病因至今仍不明確，大多數研究提示鼻息肉的發病與鼻及鼻竇黏膜的過度增生有關，促進鼻息肉增生的細胞因子多達幾十種，但是有關細胞凋亡在鼻息肉中的研究較少［1］。本實驗結果Bcl-2 在鼻息肉中絕大多數表達陽性，鼻息肉組織中Bcl-2 與Bax 陽性表達率的比值為1.16，說明鼻息肉細胞中細胞凋亡受到抑制，而鼻息肉中caspase-9 表達水平較低，鼻息肉組織中細胞凋亡信號傳導受到抑制。

目前鼻息肉的治療主要集中在手術切除和類固醇激素的使用，對于長期使用激素，即使是低劑量局部應用，激素的不良反應也同樣引起人們的重視，目前低劑量局部應用氨甲喋呤(MTX)治療鼻息肉，尤其是激素依賴型鼻息肉的患者，取得一定的療效［2］，甲氨蝶呤(MTX)在鼻息肉中作用機制與caspase 級聯反應和線粒體介導的細胞凋亡密切相關［3］，本研究的實驗結果為甲氨蝶呤(MTX)在鼻息肉中的治療提供了一定的理論依據，同時為探討鼻息肉的病因及治療提供了新的思路。細胞凋亡是極為復雜的生理過程，隨著細胞凋亡相關研究的深入，對鼻息肉的發病機制及治療提供幫助。

［1］張海令，許安廷，范獻良.鼻息肉中LIVIN、SMAC 的表達及其意義［J］.山東大學學報，2012，50:0112-0114.

［2］Buyukozturk S，Gelincik A，Aslan I，et al.Mehotrexate:can it be a choice for nasal polypsis in aspirin exacerbated respiratory disease［J］.Asthma，2009，46:1037-1041.

［3］Cho HW，Park SK，Heo KW，et al.Methotrexate induces apoptosis in nasal polyps via caspase cascades and both mitochondria-mediated and p38 mitogen-activated protein kinases/Jun N-terminal kinase pathways［J］.Am J Rhinol Allergy，2013，27:26-31.