類風濕關節炎關節液抑制間充質干細胞增殖

蔣志瓊，唐 中，譚 竟，吳碧華

(川北醫學院附屬醫院1.老年科，2.檢驗科，3.風濕科，四川南充637000)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細胞，不僅來源廣泛，體外培養增殖迅速，而且除具有支持體外造血、促進體內造血重建、組織損傷修復外還具有獨特的免疫調節作用［1］，為類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)的治療帶來了新的應用前景。但是，已有的研究［2］發現MSCs 在RA 動物模型體內并沒有發揮預期的免疫負調節和損傷組織修復作用，這是否與RA 的炎性環境致MSCs 生物學特性改變有關呢?故對此作一相關研究。

1 材料與方法

1.1 材料:1)試劑:LG-DMEM 培養液(GIBCO 公司)，反轉錄試劑盒ReverTra Ace 組合型(成都博瑞克生物技術有限公司)，成人骨髓MSCs 成骨誘導分化完全培養基(廣州賽業生物科技有限公司)。2)標本:骨髓標本來源于14 例健康志愿者。關節液來源于活動期RA 患者，共5 例，病程均超過10年。標本收集獲得本單位倫理委員會的審查批準及本人的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 骨髓MSCs 的分離培養:采用密度梯度離心法結合貼壁篩選法，取P3 代用于后續實驗。

1.2.2 RA 關節液對MSCs 增殖的影響:將MSCs 以相同的數量(約4 000 個/孔)接種于96 孔板。實驗組MSCs 培養液中分別加入10%、30%和50% 濃度的RA 關節液上清，對照組不加。培養5 d 后采用MTT 法檢測各孔吸光度值(absorbance，A 值)。

1.2.3 RA 關節液對MSCs 凋亡的影響:將MSCs 以相同的數量(約105個/孔)接種于6 孔板，實驗組MSCs 培養液中加入50%濃度的RA 關節液上清，對照組不加。培養5 d 后消化收獲各組細胞，采用凋亡試劑盒流式細胞儀檢測各組凋亡情況。

1.2.4 RA 關節液對MSCs 成骨誘導的影響:將MSCs 以相同的數量(約105個/孔)接種于6 孔板。實驗組MSCs 培養液中加入50% RA 患者關節液上清，設空白對照。培養5 d后開始加入成骨細胞誘導液誘導，每3 天完全換液1 次，共誘導7 d。茜素紅染色檢測鈣結節的形成，RT-PCR 檢測成骨細胞特異性產物骨橋蛋白基因的表達。

2 結果

2.1 MSCs 的生長特性和形態學觀察:14 例標本均成功分離培養得到MSCs。MSCs 原代培養7～12 d 可鋪滿瓶底達80%以上，傳代后細胞增殖更迅速，P3 代5～7 d 即可長滿瓶底達80%以上，細胞形態均勻一致。至P5 代，MSCs 的增殖逐漸變慢，并出現胞體變大，突起增多的老化現象。

2.2 RA 患者關節液對MSCs 增殖的影響:加入RA 患者關節液培養的實驗組MSCs，當關節液濃度為10%時的A 值為0.234 ±0.029，30%時為0.227 ±0.065，50% 時為0.194 ±0.059，顯著低于對照組的0.269 ±0.047。

2.3 RA 患者關節液對MSCs 凋亡的影響:流式細胞儀分析顯示經50% RA 患者關節液作用后的實驗組MSCs 的凋亡比例為41.53%，與對照組的45.5%接近。

2.4 RA 患者關節液對MSCs 成骨誘導的影響:50% RA 患者關節液培養5 d 的MSCs，經成骨誘導7 d 后與對照組相比，產生的礦化結節數量更多且體積更大(圖1)。實驗組MSCs 經成骨誘導7 d 后就明顯可見骨橋蛋白基因的表達，而對照組MSCs 骨橋蛋白基因的表達量還很少(圖2)。

3 討論

類風濕關節炎的發病機制目前并未真正明確，傳統的治療方法仍需發展。生物制劑的應用為RA 的治療帶來了新的希望，但治療費用昂貴、易發生各種感染，且僅能控制或阻止疾病的進展，當關節畸形后，無法修復軟骨及骨的破壞，因而有待尋求更好的治療方法。

圖1 MSCs 成骨誘導后茜素紅染色示意圖Fig 1 MSCs alizarin red staining after osteogenesis induction(×100)

圖2 RT-PCR 示骨橋蛋白基因的表達Fig 2 RT-PCR in the expression of osteopontin gene

MSCs 兼具免疫調節與組織修復功能，有望成為RA 新的治療手段。目前有研究［3］發現RA 滑液中的炎性環境可使定居于滑液纖維間質中的自身MSCs 數量降低，并會影響其功能的發揮，使其軟骨形成能力受損，且新生軟骨也可能被降解。但是RA 患者的炎性環境對外源性的MSCs 又有何影響呢?本研究發現RA 患者的炎性關節液可導致健康者MSCs 的增殖減慢，但是不會引起其凋亡增加。更進一步的研究發現，經關節液作用后的MSCs，其向成骨細胞分化的速度明顯加快了。目前研究認為MSCs 向成骨細胞分化，一般要2～3 周才能檢測到骨橋蛋白基因的表達。而經關節液作用7 d 的MSCs 經誘導1 周后就可見骨橋蛋白基因的表達，而此時未予關節液處理的MSCs 其骨橋蛋白基因的表達量是很弱的。因此認為RA 患者關節液抑制外源性MSCs 的增殖，可能是由于促進其向成骨細胞分化，因而是可以對RA的骨破壞提供治療作用的。

［1］Tyndall A，Walker UA，Cope A，et al.Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells:a review based on an interdisciplinary meeting held at the Kennedy Institute of Rheumatology Division，London，UK，31 October 2005［C］.Arthritis Res Ther，2007，9:301-301.

［2］Greish S，Abogresha N，Abdel-Hady Z，et al.Human umbilical cord mesenchymal stem cells as treatment of adjuvant rheumatoid arthritis in a rat model［J］.World J Stem Cells，2012，4:101-109.

［3］Jones E，Churchman SM，English A，et al.Mesenchymal stem cells in rheumatoid synovium:Enumeration and functional assessment in relation to synovial inflammation level［J］.Ann Rheum Dis，2010，69:450-457.