去脂軟肝方對高脂誘導大鼠脂肪肝血管性血友病因子作用的實驗研究

卞 瑤 黃文俊 姚 政 石安華 施欽柔 殷 華 陳文慧

云南中醫學院，云南昆明650500

去脂軟肝方對高脂誘導大鼠脂肪肝血管性血友病因子作用的實驗研究

卞 瑤 黃文俊 姚 政 石安華 施欽柔 殷 華 陳文慧

云南中醫學院，云南昆明650500

目的探討去脂軟肝方對高脂誘導脂肪肝大鼠肝組織血管性血友病因子的影響作用。方法高脂飲食復制大鼠脂肪肝模型，將實驗鼠隨機分為三組：正常組，模型組，去脂軟肝方組。去脂軟肝方組予去脂軟肝方藥液灌胃（1 mL/200 g）共12周；HE染色觀察肝臟脂肪變性情況；測定大鼠血清血脂、肝脂、血漿血小板聚集率及肝組織血管性血友病因子（vWF）。結果12周末模型組大鼠血脂[血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）]水平比正常組高，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠肝組織勻漿（肝臟TC、TG）與比正常組高，差異有統計學意義（P＜0.05）；去脂軟肝方組血清脂質和肝組織脂質水平比模型組低，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠血小板聚集率比正常組高，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；模型組大鼠肝臟組織中vWF比正常組高，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；去脂軟肝方組血漿血小板聚集率變化及肝組織vWF比模型組低，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。結論去脂軟肝方能明顯改善高脂誘導脂肪肝大鼠血脂、肝脂及肝組織脂肪變性。減少vWF分泌、抑制血小板聚集、減輕血管及肝竇內皮細胞損傷可能是其作用機制之一。

去脂軟肝方；高脂；脂肪肝；大鼠；血管性血友病因子

近年來，隨著社會的發展，生活水平提高，我國患脂肪肝人群數量逐年遞增，部分脂肪肝如果遷延不愈，可進展為肝纖維化甚至肝硬化[1]。因此，如何在早期阻止脂肪肝的進一步發展是目前研究的關鍵。課題組前期對云南省榮譽名中醫、著名中西醫結合肝病專家蘇漣教授以“辨病為主，從瘀而治”思路擬定的“去脂軟肝方”進行研究，證實該方具有較好的改善高脂誘導脂肪肝血脂、肝脂肝及肝組織脂肪變性作用[2-6]。但其作用機制及關鍵環節尚不完全清楚。本研究采用高脂誘導非酒精性脂肪肝大鼠，觀察脂肪肝大鼠模型與血瘀證、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）及肝竇內皮細胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）關系，探討去脂軟肝方治療脂肪肝的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠30只，體重（100±10）g，清潔級。購自四川省醫學科學院實驗動物研究所，許可證號：SCXK（川）2010-16，云南中醫學院（以下簡稱“我院”）動物房飼養，造模及觀察。

1.2 藥品及主要試劑

去脂軟肝方三七1 g、山楂15 g、菊花10 g、白術15 g、青皮6 g、莪術15 g等七味中藥）購自我院門診部藥房，由我院中藥制劑室制成流浸膏（含生藥1.44 g/mL）；膽固醇（Cholesterol）分析純，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；豬油，購自昆明沃爾瑪超市，生產日期：20110326；大鼠vWF ELISA檢測試劑盒（美國R&D公司），批號20110401A：購自昆明晨綠生物科技開發有限公司。

1.3 造模方法

將大鼠分為正常組10只，高脂飲食造模組20只，正常組大鼠每天予以標準大鼠飼料喂養，造模組大鼠每天予以高脂飼料（88%普通飼料基礎上加10%豬油，2%膽固醇）喂養，連續12周，均自由飲水。

1.4 分組及給藥

自造模之日起，高脂飲食造模組20只，隨機分為模型組10只和去脂軟肝方組10只；正常組和模型組給予生理鹽水灌胃（1 mL/200 g，每日），去脂軟肝方組按去脂軟肝方藥液灌胃（1 mL/200 g，每日），連續12周。

1.5 觀察指標

1.6 統計學方法

采用SPSS17.0軟件包進行統計學處理，計量資料以均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝組織HE染色

HE染色顯示正常組大鼠肝組織結構清晰、完整，肝小葉形態結構正常，肝細胞大小均勻，胞圓形，呈條索狀排列，可見中央靜脈。模型組大鼠肝細胞明顯腫大，呈黃色，切面油膩，中央靜脈周圍脂肪病變明顯，體積較正常明顯增加，可見超過2/3的肝細胞胞漿中出現大小不一的圓形脂滴空泡，有的空泡融合將細胞核擠向胞膜下，可見肝細胞腫大，胞漿疏松呈網狀、半透明（胞漿疏松化），嚴重者胞漿幾乎完全透明（氣球樣變）；去脂軟肝方組可見一定量的肝細胞胞漿中出現大小不一的圓形脂滴空泡。

2.2 去脂軟肝方對高脂飼料致脂肪肝模型大鼠血清脂質和肝組織脂質變化的影響

模型組大鼠血脂（血清TC、TG）與比正常組高，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠肝組織勻漿（肝臟TC、TG）與比正常組高，差異有統計學意義（P＜0.05）；去脂軟肝方組血清脂質和肝組織脂質比模型組低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 去脂軟肝方對脂肪肝大鼠血清脂質和肝組織脂質變化的影響（mmol/L，x±s）

2.3 去脂軟肝方對高脂飼料致脂肪肝模型大鼠血漿血小板聚集率變化及肝組織血管性血友病因子的影響

模型組大鼠血小板聚集率比正常組高，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；模型組大鼠肝臟組織中血管性血友病因子比正常組高，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；去脂軟肝方組血漿血小板聚集率變化及肝組織血管性血友病因子比模型組低，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 去脂軟肝方對脂肪肝大鼠血小板聚集率及肝組織血管性血友病因子的影響（x±s）

3 討論

本研究采用改良高脂飼料即88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇復制大鼠脂肪肝模型，12周末HE染色顯示模型組大鼠肝細胞明顯腫大，呈黃色，切面油膩，中央靜脈周圍脂肪病變明顯，體積較正常明顯增加，可見超過2/3的肝細胞胞漿中出現大小不一的圓形脂滴空泡，有的空泡融合將細胞核擠向胞膜下，可見肝細胞腫大，胞漿疏松呈網狀、半透明（胞漿疏松化），嚴重者胞漿幾乎完全透明（氣球樣變），同時，大鼠血清與肝組織勻漿檢測TC、TG均有不同程度的增高，出現典型脂肪肝大鼠模型。

目前脂肪肝的發病機制尚不完全清楚，有研究表明脂肪肝患者大多存在高血脂及微循環障礙的改變[6]，一方面血脂升高、脂質過氧化反應加劇能夠促進血小板高聚集率，發生血小板活化[7-8]；另一方面血小板活化，進一步引起血液高凝狀態的出現，血液黏度增高，血液循環阻力升高，加重微循環障礙，從而加重血管內皮損傷、肝細胞損傷，導致脂肪肝病變發展。

vWF是血管內皮細胞受損的重要標志物，通過測定vWF的水平可以判定患者內皮細胞損傷的慢性或急性階段[9]。vWF是介導血小板與血管內皮下組織黏附的主要分子，目前已知它能參與血小板-血管壁，血小板-血小板之間的相互作用，在血小板活化、血液凝固中發揮重要作用[10]，有研究表明，vWF在肝臟損傷和修復過程中發揮積極作用，肝組織中vWF可沿肝竇的表達使肝竇內血流處于血栓前狀態，易于形成微血栓，導致微循環障礙，肝臟微循環障礙可以影響相應供血區域肝細胞的營養狀況，造成肝細胞缺血缺氧[11]。有學者也認為vWF升高與肝臟血管內皮損害程度成正比，可以作為反映肝臟血管內皮損害的一個非特異性指標[12-13]。

本實驗中發現，12周末模型大鼠血清與肝組織勻漿檢測TC、TG均有不同程度的增高的同時，血漿血小板聚集率升高，肝組織vWF分泌增多，且與正常組比差異有統計學意義（P＜0.05），表明肝組織vWF因子分泌增多，血小板聚集率增加，發生血小板活化，加重微循環障礙，從而影響到肝竇內皮細胞（LSEC）。表明脂肪肝模型大鼠與vWF、血小板聚集率、血小板活化及肝竇內皮細胞損傷之間有一定關聯。

云南著名中西醫結合肝病專家蘇漣教授對早期脂肪肝提出“肝郁脾虛，虛瘀交結”病理特點，并從多年臨床用藥經驗中，反復篩選組成以三七、莪術、赤芍等活血化瘀為主的“去脂脂軟肝方”方藥治療脂肪肝取得明顯的臨床療效。從脂質代謝的各個環節進行多項藥效學研究發現其對高脂飼料所致的高血脂、肝脂有降低作用，同時還能明顯降低停飼高脂飼料后大鼠的肝脂、血脂水平，表明其不僅能抑制脂質的吸收，還能促進脂質的降解。本研究與以往研究結果相一致[2-6]。因此脂肪肝的中醫治療從瘀而治，有臨床及藥理研究的支持，血小板活化是血瘀證產生的重要病理生理基礎，運用活血化瘀為主方藥可以抑制血小板聚集，減少血小板活化，從而改善肝臟微循環障礙，減輕脂肪肝病變發展。本研究結果表明以活血化瘀為主的“去脂脂軟肝方”可能是通過減少vWF分泌抑制血小板聚集，減少血小板活化，減輕血管及肝竇內皮細胞損傷途徑來實現的。

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Experimental research of Quzhi Ruan'gan Prescription in effect of von Willebrand factor in rats with fatty liver caused by high fat

BIAN YaoHUANG WenjunYAO ZhengSHI AnhuaSHI QinrouYIN HuaCHEN Wenhui
Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Yunnan Province,Kunming650500,China

Objective To investigate the impact of Quzhi Ruan'gan Prescription in von Willebrand factor(vWF)of rats with fatty liver caused by high fat.Methods The model of rats with fatty liver was made by high fat diet,and the model rats were randomized to 3 groups:normal group,model group and Quzhi Ruan'gan Prescription group.Quzhi Ruan'gan Prescription group was treated with gavage of Quzhi Ruan'gan Prescription(1 mL/200 g)for 12 weeks.The condition of fatty degeneration of liver was observed with HE staining.The serum lipid,liver lipid,the rate of serum platelet aggregation and vWF in liver tissue were tested.Results At the end of 12th weekend,the levels of serum lipid(TC,TG)in model group were higher than those in normal group,the differences were statistically significant(P＜0.05);the levels of serum lipid and liver lipid in Quzhi Ruan'gan Prescription group were lower than those in model group(P＜0.05); the rate of serum platelet aggregation in the model group was higher than that of normal group,the difference was highly statistically significant(P＜0.01);the vWF in liver tissue in the model group was higher than that of normal group, the difference was highly statistically significant(P＜0.01);the rate of serum platelet aggregation and vWF in liver tissue of Quzhi Ruan'gan Prescription group were lower than those in model group,the differences were highly statistically significant(P＜0.01).Conclusion Quzhi Ruan'gan Prescription can improve the conditions of high fat resulting in serum lipid,liver lipid and liver fatty degeneration of rats with fatty liver obviously.One of the mechanism may be associated with reduction of the secretion of vWF,inhibition of platelet aggregation,lightening the damage of blood vessel and liver sinusoidal endothelial cell.

Quzhi Ruan'gan Prescription;High fat;Fatty liver;Rats;Von Willebrand factor

R575.2

A

1673-7210（2014）01（a）-0004-03

2013-09-03本文編輯：張瑜杰）

國家自然科學基金資助項目（編號81160492）。

卞瑤（1964.7-），女，江蘇句容人，副教授，云南中醫學院繼職學院院長，長期從事生物化學的理論及實驗教學進行物質代謝的基礎研究。

陳文慧（1963.10-），女，廣東興寧人，教授，云南中醫學院基礎醫學院副院長，長期從事溫病學、中西醫結合基礎的教學及科研工作。