m iRNA-26a在良、惡性腹水鑒別診斷中的意義

李 曦 何 敏 鄒 兵

北京大學深圳醫院消化內科，廣東深圳518036

m iRNA-26a在良、惡性腹水鑒別診斷中的意義

李 曦 何 敏 鄒 兵▲

北京大學深圳醫院消化內科，廣東深圳518036

目的探討miRNA-26a在良、惡性腹水鑒別診斷中的意義。方法收集北京大學深圳醫院2011年9月～2014年3月門診及住院患者60例，包括20例肝硬化腹水患者（肝硬化腹水組），20例結核性腹水患者（結核性腹水組），20例惡性腹水患者（惡性腹水組）。采用實時定量PCR（qRT-PCR）方法檢測并比較各組血清miRNA-26a、甲胎蛋白（AFP）、糖類抗原125（CA125）的表達。結果惡性腹水組血清CA125表達高于結核性腹水組和肝硬化腹水組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。AFP、miRNA-26a在結核性腹水組及肝硬化腹水組表達差異無統計學意義（P＞0.05）；AFP和miRNA-26a在惡性腹水組患者血清表達明顯高于結核性腹水組和肝硬化腹水組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論miRNA-26a水平將來有可能有助于良、惡性腹水的鑒別診斷。

m iRNA-26a；肝硬化腹水；結核性腹水；惡性腹水

在B超、MRI、CT、PET-CT等影像技術檢查指導下，以及在臨床各種常見生物化學檢測指標（如腫瘤標志物等）幫助下，腹水患者的診斷準確性有了顯著性提高。但是臨床上仍有腹水患者診斷不明，有時候良性和惡性腹水的鑒別診斷仍然較困難，甚至發生誤診。一小部分患者仍需要借助腹腔鏡腹腔探查或剖腹探查，而這些有創檢查使患者從身體和心理上帶來較多影響。甚至還有極少部分患者在經過探查之后最終仍發生誤診。為了更準確地明確腹水原因，同時減少患者痛苦，有必要尋找一種更好的檢測指標，以提高臨床診斷的準確性。

microRNA（miRNA）作為非編碼小分子RNA，在人體中，至今已經被發現超過1000種。它存在各種不同生物物種當中。成熟miRNA具有高度的保守性，組織特異性，能參與基因轉錄后調控[1]。每種miRNA可能調節多種miRNA的表達，對蛋白編碼基因進行轉錄后調控，參與細胞分化、增殖和凋亡，并與炎癥和各類疾病發生，發展等各種過程密切相關[1-3]。由于miRNA在血清和體液具體較高的穩定性，因此可能作為疾病診斷和鑒別診斷的重要指標。

為明確miRNA-26a是否有助于腹水鑒別，本研究選取惡性腹水患者作為研究對象，以肝硬化和結核性腹水患者作為對照，檢測miRNA-26a在患者血清的表達，探討miRNA-26a在良惡性腹水鑒別中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集北京大學深圳醫院（以下簡稱“我院”）2011年9月～2014年3月門診及住院患者，其中結核性腹水20例（結核性腹水組），其中男5例，女15例，平均年齡（34.9±7.9）歲；乙肝肝硬化失代償期且有腹水患者20例（肝硬化腹水組），其中男14例，女6例，平均年齡（48.1±10.0）歲；惡性腫瘤所致腹水患者20例（惡性腹水組，包括肝癌8例，胃癌4例，結腸癌4例，卵巢癌3例，胰腺癌1例），其中男13例，女7例，平均年齡（57.1±14.9）歲。結核性腹水組患者年齡小于其他兩組（P＜0.05）；肝硬化腹水組、惡性腹水組、結核性腹水組患者性別等一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入和排除標準

①乙肝肝硬化腹水患者納入和排除標準：具有慢性乙型病毒性肝炎病史，或伴有門靜脈高壓，肝功能減退表現；影象學檢查，如CT、B超或MRI檢查支持肝硬化的診斷，排除其他各種原因引起的肝硬化，如酒精性肝硬化、血吸蟲性肝硬化、Wilson病、膽汁淤積性肝硬化等，排除合并其他嚴重的器質性疾病，如合并心功能衰竭、腎功能衰竭、呼吸功能衰竭、惡性腫瘤等。②結核性腹水患者納入和排除標準：根據患者結核病史、臨床癥狀、體征、腹水常規和腹水細胞學、其他化驗結果，以及參照可能的PPD皮試陽性，腹水或痰涂片抗酸染色陽性以及影象學結果能夠臨床明確診斷的結核性腹水患者；通過正規四聯抗結核治療2周以上有效；或腹膜病理活檢確診，排除其他原因引起的腹水，排除合并其他嚴重器質性疾病。③惡性腹水患者納入和排除標準：臨床表現符合，且影像學如B超、CT、MRI、PET-CT提示患者有惡性腫瘤且合并腹水；胃腸鏡、腹腔鏡、腹水細胞學或手術病理確診惡性腫瘤的腹水患者，排除其他嚴重性器質性疾病和其他原因引起的腹水。本研究經過醫院倫理委員會通過。

1.3 方法

1.3.1 標本的采集和處理獲得血液標本之后，將其靜置，等待血液凝固后析出血清，之后吸取上層液體和抗凝血液樣本，5000 r/min，離心半徑10 cm，離心12 min，提取上清液。

1.3.2 腫瘤標志物檢測血清樣本中甲胎蛋白（AFP），糖類抗原125（CA125）等濃度采用化學發光分析法進行測定，由我院檢驗科進行檢測。試劑盒由天津市協和醫藥科技有限公司提供。

1.3.3miRNA26a的檢測采用常規qRT-PCR方法檢測方法，主要包括以下步驟：①總RNA提取，根據RNA提取試劑盒完成；②總RNA純度和完整性檢測；③逆轉錄；④定量PCR。大致具體過程如下：在采血后的6 h內，分別吸取200μL血漿，使用miRcutemiRNA提取試劑盒的操作方法，進行miRNA的提取。完成后，吸取11μL的miRNA提取液，37℃反應1 h加多聚腺苷酸，然后吸取2μL反應液37℃反應1 h進行cDNA的合成。上述完成后，采用實時定量PCR的方法，檢測miRNA-26a的表達情況；采用20μL的反應體系，每孔加入5μL的cDNA，0.5μL上游引物和下游引物，10μL 2X stbr greenpcrmastermix，6.5μL的雙蒸水。反應條件如下：94℃反應1 min，94℃反應15 s，60℃反應30 s退火，72℃反應30 s延伸，反應進行42個循環。其中定量PCR用酶（SYBR Green PCR Master Mix）購自TOYOBO公司。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義

2 結果

惡性腹水組血清CA125表達高于結核性腹水組和肝硬化腹水組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。AFP、miRNA-26a在結核性腹水組及肝硬化腹水組表達差異無統計學意義（P＞0.05）；AFP和miRNA-26a在惡性腹水組患者血清表達明顯高于結核性腹水組和肝硬化腹水組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。其中，惡性腹水患者中有8名肝癌患者，如果剔除這些肝癌患者，AFP在各組中差異無統計學意義（P＞0.05）。

癌性腹水患者血清檢測提示AFP、CA125高于正常值比例分別為40%、45%；以0.025作為參考值，miRNA-26a高于0.025的比例為45%，在結核性腹水患者血清中AFP、CA125高于正常值比例分別為0%、55%，miRNA-26a高于0.025的比例為10%；在肝硬化腹水患者血清中，AFP、CA125高于正常值比例分別為15%、50%，miRNA-26a高于0.025的比例為10%。

表1 AFP、CA125、m iRNA-26a在各組血清中表達情況±s）

表1 AFP、CA125、m iRNA-26a在各組血清中表達情況±s）

注：與惡性腹水組比較，*P＜0.05；AFP：甲胎蛋白；CA125：糖類抗原125

?

3 討論

相對過去，近年來腹水的診斷變得越來越容易，主要是原因是影像學技術的不斷發展，比如CT、MRI、PET-CT等。此外，一些血清和腹水的標志物檢測也對診斷提供了一些幫助。如果仍無法明確診斷的，還可以最終采用腹腔鏡等方式探查腹腔，幫助明確診斷。但是即使如此，臨床上仍然有少部分腹水患者診斷不清，部分是因擔心手術風險，拒絕腹腔鏡檢查，或因為身體狀況不佳，無法承受腹腔鏡檢查，還有極少部分患者即使行腹腔鏡檢查，仍然無法找到原因。而傳統的血清學標志物如腫瘤標志物等的檢測，似乎對此類患者也束手無策。

在一些研究中認為AFP和CA125有助于良、惡性胸腹水的診斷。AFP被多數研究認為是到目前為止原發性肝細胞癌的最為靈敏和特性的腫瘤指標。CA125是一種高分子質量糖類抗原，其被認為是婦科腫瘤，特別是卵巢癌的最重要的血清學標志物之一，同時可在其他多種腫瘤和良性疾病中升[4-6]。本研究觀察到AFP在惡性腹水患者血清中的表達水平和高于正常值的比例明顯高于良性腹水組（包括結核性腹水和肝硬化腹水組），提示AFP的確有利于良惡性腹水的診斷，但AFP作為腹水鑒別的標志物時有明顯缺陷，考慮到本研究中肝癌患者高達8例，如果剔除這些入組的肝癌患者，其他惡性腹水患者AFP水平和升高比例與良性腹水主相比，沒有明顯統計學差異。因此AFP在研究中是否能幫助腹水的鑒別診斷，可能取決于入組的肝癌患者的比例和數量。本研究中發現CA125的表達水平在惡性腹水患者中較高，但與其他組相比沒有統計學意義。可能原因是本次研究中，入組的婦科腫瘤患者比例少有關，因為CA125在婦科腫瘤中升高更為明顯。由此可見，盡管這些腫瘤標志物對診斷有幫助，但似乎幫助有一定限制，因此，有必要尋找一種新的血清學標志物來幫助腹水患者的診斷。

非編碼RNA研究是生物醫學領域近年來，可與人類基因組計劃相提并論的重大成果之一[1-2]。miRNA是近年新發現的非編碼RNA的一種，它廣泛存在于真核生物中，在物種之間具有系統進化上的高度保守性、時序性和組織特異性。它與多種生物學過程密切相關，包括發育、細胞分化、增殖、凋亡、病毒感染和腫瘤發生和發展等[2]。miRNA能影響基因表達的主要機制是：通過與靶基因的基因非編碼區特異性的堿基配對導致其降解或翻譯阻遏，從而對基因進行轉錄后的調控[2]。

已有研究表明，miRNA與腫瘤發生密切相關，miRNA一部分可能調節腫瘤細胞的增殖和存活，促進腫瘤的生長和侵襲，另一部分可能參與抑制腫瘤細胞生長。miRNA將來可能作為一個腫瘤監測指標和治療靶點已為多數人認可[7-9]。

本研究發現miRNA-26a在惡性腹水患者血清的表達明顯高于在結核性腹水和肝硬化腹水患者，這提示miRNA-26a水平有可能幫助良，惡性腹水的鑒別診斷。盡管關于miRNA-26a的文獻不多，但它被認為是一種與腫瘤密切相關的非編碼RNA。miRNA-26a可能作為一種腫瘤抑制因子，顯著降低裸鼠在肝腫瘤負荷。miRNA-26a可以通過依賴和非依賴于細胞周期蛋白途徑來抑制肝癌細胞生長[10]。高表達的miRNA-26a的乳腺癌患者對他莫昔芬（抗腫瘤藥物）反應較好[11]。miRNA-26a還可以通用不同途徑EZH2抑制鼻咽癌細胞生長[12]。這些提示miRNA-26a的變化與腫瘤疾病的發生存在一定相關性，但miRNA-26a如何參與腫瘤發生，發展的機制仍不明確。

雖然本研究觀察到miRNA-26a在惡性腹水患者血清的表達有升高，但目前尚不清楚miRNA-26a在惡性腹水患者血清的表達明顯升高的原因，也不清楚其是否參與了腫瘤的發生和發展過程。由于缺乏相關大規模研究和以及試劑和相關方法的影響，無法確定miRNA-26a正常值范圍，尚無法運用于臨床，但是隨著進一步研究的深入，聯合運用miRNA-26a和其他腫瘤標志物進行檢查，幫助腹水的鑒別診斷，將成為可能。下一步，將研究良、惡性腹水患者血清miRNA-26a升高的可能機制。

[1]Guarnieri DJ，DiLeone RJ.MicroRNAs：a new class of gene regulators[J].Ann Med，2008，40（3）：197-208.

[2]Jiang X，Tsitsiou E，Herrick SE，et al.MicroRNAs and the regulation of fibrosis[J].FEBSJ，2010，277（9）：2015-2021.

[3]Baek D，Villen J，Shin C，et al.The impact ofmicroRNAs on protein output[J].Nature，2008，455（7209）：64-71.

[4]李學文，肖創清.肝硬化患者血清及腹水中CA199，CA125和CA153的臨床意義[J].中國現代醫學雜志，2006，16（24）：188-189.

[5]單國棟，金恩蕓，楊銘，等.CA125與腺苷脫氨酶在結核性腹膜炎患者中的臨床意義[J].中華內科雜志，2006，45（23）：938-939.

[6]李曦，鄒兵.結核性腹水和惡性腹水的鑒別[J].中外醫學研究，2010，8（2）：22-23.

[7]Zhang X，Chen C，Wu M，et al.Plasma microRNA profile as a predictor of early virological response to interferon treatment in chronic hepatitis B patients[J].Antivir Ther，2012，17（7）：1243-1253.

[8]Banaudha KK，Verma M.The Role of MicroRNAs in the ManagementofLiverCancer[J].MethodsMolBio，2012，863：241-251.

[9]Fang Y，FangD，Hu J.MicroRNA and its roles in esophageal cancer[J].Med SciMonit，2012，18（3）：22-30.

[10]Chen L，Zheng J，Zhang Y，et al.Tumor-specific expression of microRNA-26a suppresses human hepatocellularcarcinoma growth via cyclin-dependent and-independent pathways[J].Mol Ther，2011，19（8）：1521-1528.

[11]Jansen MP，Reijm EA，Sieuwerts AM，et al.High miR-26a and low CDC2 levels associate with decreased EZH2 expression and with favorable outcome on tamoxifen in metastatic breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat，2012，133（3）：937-947.

[12]Alajez NM，ShiW，Hui AB，et al.Enhancer of Zeste homolog 2（EZH2）is overexpressed in recurrent nasopharyngeal carcinoma and is regulated by miR-26a，miR-101，andmiR-98[J].Cell Death Dis，2010，1：e85.

Value ofm iRNA-26a level in benign or malignant ascites

LIXi HEMin ZOU Bing▲
Department ofGastroenterology,Peking University Shenzhen Hospital,Guangdong Province,Shenzhen 518036,China

Objective To investigate the value of serum miRNA-26a level in patientswith benign ormalignant ascites. M ethods 60 cases in Peking University Shenzhen Hospital from September 2011 to March 2014 were included and divided into hepatic cirrhosis ascites group with 20 cases,tuberculous ascites group with 20 cases and malignant ascites group with 20 cases.miRNA-26a,AFP,CA125 level in blood serum weremeasured by qRT-PCR.Results The serum CA125 in malignant ascites group was higher than those in hepatic cirrhosis ascites group and tuberculous ascites group,but the differencewas not statistically significant(P＞0.05).The differences of AFP,miRNA-26a between tuberculousascitesgroup and hepatic cirrhosisascitesgroup was notstatistically significant(P＞0.05);the AFP,miRNA-26a in malignant ascites group were all higher than those in hepatic cirrhosis ascites group and tuberculous ascites group, the differences were statistically significant(P＜0.05).Conclusion Diagnosis of benign ormalignant ascitesmay benefit from themeasurement ofmiRNA-26a level.

miRNA-26a;Hepatic cirrhosis ascites;Tuberculous ascites;Malignant ascites

R442.5

A

1673-7210（2014）08（b）-0051-04

2014-05-03本文編輯：李繼翔）

廣東省深圳市科技計劃項目（編號201203003）。

▲通訊作者