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葛暢 許春偉 王魯平 方園 張玉萍

[摘要] 目的 探討甲基化酶抑制劑5'-氮雜-2'-脫氧胞苷（5'-Aza-2'-deoxycytidine，5'-Aza-CdR）對結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化水平及蛋白表達的影響。 方法 用不同濃度（0.5、1.0、1.5 μmol/L）5'-Aza-CdR處理結直腸癌細胞株HT-29和LoVo。應用TaqMan探針為基礎的實時定量PCR（Methylight）方法、SYBR Green PCR方法及蛋白印跡實驗（Western blot）檢測藥物處理前后HT-29和LoVo細胞中Wif-1基因的甲基化狀態、mRNA和蛋白表達。 結果 Methylight檢測HT-29和LoVo細胞中Wif-1蛋白在藥物作用后異常甲基化得到逆轉；實時熒光定量PCR和Western Blot檢測到0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR處理后Wif-1基因mRNA和蛋白重新表達，實時熒光定量PCR檢測DMSO對照組和不同濃度5'-Aza-CdR（0.5、1.0、1.5 μmol/L）在HT-29細胞株相對表達量分別為（1.000±0.000）、（1.207±0.052）、（1.790±0.033）和（2.016±0.123）；在LoVo細胞株相對表達量分別為（1.000±0.000）、（1.294±0.048）、（1.893±0.061）和（2.204±0.041）。Western blot檢測Wif-1蛋白檢測DMSO對照組和不同濃度5'-Aza-CdR在HT-29細胞株相對表達量分別為（0.456±0.040）、（0.511±0.025）、（0.857±0.031）和（0.934±0.047）；LoVo細胞株相對表達量分別為（0.842±0.032）、（0.844±0.044）、（0.854±0.037）和（0.856±0.034）。以上作用均呈時間、劑量依賴性，Wif-1基因mRNA在HT-29細胞株表達和LoVo細胞株表達差異均有高度統計學意義（F=144.823，P=0.000；F=476.195，P=0.000）。Wif-1蛋白表達在HT-29細胞株表達差異有高度統計學意義（F=129.674，P=0.000），但Wif-1蛋白表達在LoVo細胞株表達差異無統計學意義（F=0.117，P=0.948）。 結論 結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1啟動子甲基化可能是導致該基因表達下調甚至失活的主要原因。5'-Aza-CdR能夠較成功地逆轉結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因的甲基化狀態，并能恢復mRNA及蛋白重新表達。

[關鍵詞] DNA甲基化；5'-Aza-CdR；HT-29；LoVo；Wif-1基因

[中圖分類號] R735.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（b）-0016-06

Effect of 5-Aza-dC on mRNA expression， protein expression and methylation of Wif-1 gene status in HT-29 and LoVo Colorectal cancer

GE Chang XU Chunwei WANG Luping FANG Yuan ZHANG Yuping

Department of Pathology， the Military General Hospital of Beijing PLA， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine （5-Aza-dC）， a methylation inhibitor， on the mRNA expression， protein expression of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. Methods HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines was treated with different dosages of 5-Aza-dC. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines were treated with different dosages of 5-Aza-dC （0.5， 1.0， 1.5 μmol/L）. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. Results Methylight detection showed that the Wif-1 gene methylation had effectively been reverserd by 5-Aza-dC. Moreover， the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-dC increased respectively in HT-29 Colorectal cell line[（1.000±0.000）， （1.207±0.052）， （1.790±0.033）， （2.016±0.123）]， and the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-Dc increased respectively in LoVo Colorectal cell line [（1.000±0.000）， （1.294±0.048）， （1.893±0.061）， （2.204±0.041）]. Western blot indicated that 5-Aza-dC could recover the Wif-1 protein expression respectively in HT-29 Colorectal cell line [（0.456±0.040）， （0.511±0.025）， （0.857±0.031）， （0.934±0.047）]， and the protein expression was （0.842±0.032）， （0.844±0.044）， （0.854±0.037）， （0.856±0.034）， respectively in LoVo Colorectal cell line. The Wif-1 gene mRNA effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=144.823， P=0.000） and LoVo Colorectal cancer line （F=476.195， P=0.000）， and the Wif-1 protein effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=129.674， P=0.000）， but without statistical significance in LoVo Colorectal cancer line （F=0.117， P=0.948）. Conclusion The methylation of promoter region is a main cause for transcriptional inactivation of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. 5-Aza-dC may effectively reactivate the gene transcription through a demethylation role.

[Key words] DNA methylation； 5-Aza-dC； HT-29； LoVo； Wif-1 gene

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為最常見惡性腫瘤之一，其發病率僅位于肺癌和前列腺癌（女性為乳腺癌）之后，居第3位，而每年CRC病死率約占全部惡性腫瘤死亡總人數的8%，在惡性腫瘤死因中居第4位[1]。CRC的發生與發展與癌基因和抑癌基因的缺失、擴增或突變有關。有些基因在染色質水平上發生表型遺傳修飾改變也會導致表達下調。表型遺傳修飾最多見的是CpG島（CpG island）的甲基化改變。Wif-1基因（Wnt inhibitory factor-1）定位于人類染色體12q14.3上，由10個外顯子組成，全長約200 kb。Wnt/β-catenin信號傳導通路是調控細胞生長增殖的重要途徑之一，其異常激活已發現與多種人類腫瘤密切相關[2]。Wif-1基因是這條通路的下游區基因也是這條通路的拮抗基因。Wif-1基因的高甲基化在多種腫瘤中都已證實是存在的，它作為一種腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG），其啟動子的高甲基化參與了腫瘤的發生發展。本實驗通過研究5'-氮雜-2'-脫氧胞苷（5'-Aza-CdR）對HT-29和LoVo細胞株作用后Wif-1基因的DNA層面、mRNA層面和蛋白層面的改變，探討腫瘤發生發展過程中Wif-1基因失活的甲基化機制及藥物恢復Wif-1基因表達的可能性，以期尋找CRC的腫瘤標志物及新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

結直腸癌細胞株HT-29和LoVo（北京大學醫學部107實驗室）；DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）；核酸蛋白質濃度測量儀B-500（上海創萌生物科技有限公司），DNA甲基化修飾試劑盒及甲基化陽性/陰性對照（美國ZYMO公司）；qPCR反應試劑ROX（TaKaRa公司）；Mix（上海輝睿生物科技有限公司）；Mx3000P定量PCR擴增儀（美國Stratagene公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；5'-Aza-CdR（美國Sigma公司），以DMSO溶劑充分溶解后配制成0.1 μmol/L的母液，分裝后-80℃保存；Wif-1和內參β-actin（美國Santa Cruz公司），Western blot相關試劑（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 細胞培養和干預

結直腸癌細胞株HT-29和LoVo置于10%胎牛血清和100 μ/mL青霉素、鏈霉素的RPMI1640的培養基中常規培養，胰酶消化傳代。取貼壁生長良好的細胞以RPMI1640調整細胞密度至2×106/mL，接種于六孔培養板。干預的LoVo和HT-29細胞分別加入0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR混合培養液，每24小時更換新鮮培養基，連續作用72 h；以HT-29和LoVo分別加入等量DMSO溶劑培養作為對照（0 μmol/L）。

1.3 Methylight方法

取對數生長期的HT-29和LoVo細胞株，胰酶消化后抽提DNA。抽提DNA按DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）說明提取上述兩種細胞不同濃度梯度的細胞DNA，用紫外分光光度儀（上海創萌生物科技有限公司）測DNA濃度，以DNA濃度在25 ng/μL為最低濃度，使用DNA修飾試劑盒進行亞硫酸氫鹽修飾，按照試劑盒說明書操作，Wif-1基因甲基化引物和探針設計：Wif-1基因序列參照GenBank。甲基化引物和探針由Beacon Designer 7.9軟件設計，其引物序列上游引物：5'-TAAACGGGAATAGTTTTGGTTGAGG-3'；下游引物：5'- TACTACTCAAAACCTCCTCCTCGCTAC-3'；探針：FAM 5'- CTCCTCGTACCGCACCTACGCAACCTA-3' BHQ1，內參β-actin基因甲基化按文獻[3]設計，上游引物：5'-TGGTCATC CAGGTTTAGTAACT-3'，下游引物：5'-AACCAATAAAC CTACTCCTCCCTTAA-3'，探針：FAM 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3'BHQ1。PCR反應總體系為20 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL；修飾后的DNA模板2 μL；上、下游引物各1 μL（10 pmol）；探針FAM 0.4 μL（10 pmol）；ROX 0.3 μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，共50個循環；72℃延伸5 min，4℃冷卻5 min。經亞硫酸氫鹽修飾的Human Methylated & Non-methylated DNA Set作為陽性、陰性對照，水為空白對照。

1.4 實時熒光定量PCR分析結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因mRNA的表達情況

取對數生長期的HT-29和LoVo細胞，胰酶消化后抽提細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，行實時熒光定量PCR。Wif-1引物由Primer Premier 5.0軟件設計，上游引物：5'- GTTCCACGGACCTCACT-3'，下游引物：5'-ATGTCGGAGTTCACCAGA-3'；內參基因GAPDH上游引物：5'-GGCTGCTTTTAACTCTGG-3'，下游引物：5'-GGAGGGATCTCGCTCC-3'。20 Μl PCR反應體系含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、上、下游引物（10 μmol/L）各1、0.3 μL ROX Reference Dye（50×）、4.0 μL DNA模板、3.7 μL dH2O。反應條件為95℃預變性5 min；95℃ 10 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s，共40個循環；72℃延伸1 min，70℃延伸30 s，95℃延伸30 s。實驗重復3次，取均值。擴增完畢后分析熔解曲線，采用2-ΔΔCt法分析Wif-1 mRNA表達。ΔΔCt=（Ct處理組目的基因-Ct處理組內參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內參基因）。

1.5 Western blot分析結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白的表達情況

取對數生長期的HT-29和LoVo細胞，在上述兩種細胞株各個濃度梯度的每管細胞中加入80 μL蛋白裂解和1 μL蛋白酶抑制劑PMSF液于冰上裂解30 min。15 000 r/min 37℃離心，10 min后取上清液提取總蛋白，BCA法蛋白定量。總蛋白100℃變性5 min后，配制濃度為12%的SDS-PAGE凝膠，進行蛋白質電泳，蛋白電泳分離后經電轉移槽轉移至PVDF膜。BSA室溫封閉2 h后，PVDF膜置于1∶200稀釋的Wif-1單克隆抗體稀釋液中4℃冰箱內培養過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再置于1∶20 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG稀釋液中37℃培養2 h，TBST洗膜4次，每次10 min，然后加入ECL發光液顯影，采集并分析處理圖像。凝膠成像系統攝像并分析各條帶吸光度值，以0.5 μmol/L 5'-Aza-CdR條帶吸光度值（A）/β-actin條帶吸光度值（A）為基準，設置為1。以目的基因條帶吸光度值（A）/β-actin條帶吸光度值（A）作為Wif-1蛋白的相對表達強度。實驗重復3次，取其平均值。

1.6 MethyLight結果判斷標準

同時擴增目的基因（Wif-1）和內參基因（β-actin），根據標準曲線得到兩者的原始拷貝數，計算標準甲基化指數（the normalized index of methylation，NIM）。其定義為：NIM=[（Wif-1 sample/Wif-1 positive）/（β-actin sample/β-actin positive）]×100，其中Wif-1 sample指樣本中甲基化Wif-1基因的拷貝數，Wif-1 positive指陽性對照中甲基化Wif-1基因的拷貝數，β-actin sample指樣本中甲基化Wif-1基因的拷貝數，β-actin positve指陽性對照中甲基化Wif-1基因的拷貝數。NIM≥4為甲基化，NIM<4為非甲基化[4]。

1.7 統計學方法

采用統計軟件SPSS 19.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），行配對t檢驗，并設定P值為雙側分布，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化狀況

將陽性對照按10的倍數稀釋成1×100～1×10-6 7個濃度梯度制作標準曲線（其拷貝數為103～109/mL）。各濃度梯度反應均做復孔。MethyLight的線性范圍為104～108拷貝/mL，R2為0.907。實時熒光定量PCR得出數據按MethyLight結果判斷標準，在DMSO對照組、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR中HT-29和LoVo細胞株中Wif-1基因甲基化狀態分別為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化。見表1、圖1。

表1 HT-29和LoVo細胞株中Wif-1基因甲基化狀況

2.2 結直腸癌細胞株LoVo和HT-29中Wif-1基因mRNA表達狀況

實時熒光定量PCR得出的數據檢驗擴增效率（E）通過公式E=2-1/斜率-1計算，Wif-1基因mRNA為0.945，GAPDH基因mRNA為0.977，兩個基因的擴增效率相差<5%，符合用2-ΔΔCt法相對定量分析條件。經2-ΔΔCt法分析并以對照組、各不同濃度實驗分組為橫坐標，將測出相應的平均相對定量比值為縱坐標，繪出柱狀圖后發現0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1基因的mRNA表達水平較DMSO對照組上調，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=144.823，P=0.000），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有統計學意義（t = 6.945，P = 0.020；t = 41.629，P = 0.001；t = 14.262，P = 0.005）；LoVo細胞株中Wif-1 mRNA表達水平較DMSO對照組上調，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=476.195，P=0.000），與對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有高度統計學意義（t = 10.656，P = 0.009；t = 25.486，P = 0.002；t = 51.323，P = 0.000）。見表2、圖2。

表2 HT-29和LoVo細胞株中Wif-1基因mRNA表達狀況（x±s）

注：與DMSO對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

2.3結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白表達狀況

Western blot結果運用Image J軟件進行條帶圖像分析，獲得HT-29和LoVo細胞株各條帶光密度值，并計算出兩種細胞在各組中的平均光密度比值，進行半定量分析及統計學分析，并以各實驗分組為橫坐標，將測出相應的平均光密度比值為縱坐標，繪出柱狀圖后發現0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1蛋白表達水平較DMSO對照組上調，并且有藥物濃度依賴性（F=129.674，P=0.000），與DMSO對照組比較，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組比較，差異均有統計學意義（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo細胞株中Wif-1基因的蛋白表達水平較DMSO對照組略微上調，并且有藥物濃度依賴性但差異無統計學意義（F=0.117，P=0.948），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組差異均有高度統計學意義（t = 19.414，P = 0.003；t = 30.468，P = 0.001；t = 102.233，P = 0.000）。見表3、圖3。

表3 HT-29和LoVo細胞株中Wif-1蛋白表達狀況（x±s）

注：與DMSO對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

A：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中HT-29細胞株Wif-1蛋白Westernblot條帶圖；B：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中HT-29細胞株Wif-1蛋白柱狀圖；C：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中LoVo細胞株Wif-1蛋白Westernblot條帶圖；D：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中LoVo細胞株Wif-1蛋白柱狀圖

圖3 各組HT-29細胞株及LoVo細胞株Wif-1蛋白表達

3討論

CRC是最常見的消化道惡性腫瘤之一，每年全球新發病例達123萬，病死率約為發病率的1/2。我國CRC發病率雖低于西方發達國家，但近20年來CRC的發病率仍在逐漸上升，同時，其發病年齡有增高趨勢。近年研究表明CRC的發病是多因素、多階段、多基因連續累積發生的過程，除遺傳學改變外，表觀遺傳學改變亦參與CRC的發生、發展過程。表觀遺傳學是指不涉及DNA序列改變，但基因表達卻發生可遺傳的改變，DNA甲基化、組蛋白修飾、MicroRNA等是表觀遺傳學的主要形式。與腫瘤發生關系最密切的是DNA甲基化修飾異常，其中包括基因組去甲基化及部分區域高度甲基化兩種形式。DNA甲基化可以導致癌相關基因沉默，病變迅速進展為癌。CRC有若干高度甲基化基因，若能認識CRC中基因異常DNA甲基化，將可能獲得CRC診斷的腫瘤標志物及新的治療靶點[5-7]。

經典Wnt/β-catenin信號通路發現迄今已數十年，作為一條高度保守的信號通路在動物胚胎的器官發育各個階段均發揮異常重要的作用。Wif-1基因是Wnt/β-catenin信號傳導通路的拮抗基因之一，屬SFRP拮抗家族，在種族間高度保守，最早在人類視網膜中發現[8]。它主要通過捆綁Wnt信號蛋白，阻止其與Frizzled受體相互作用，從而抑制通路的異常激活。Nosho等[9]的研究發現，在早期CRC中伴有Wif-1表達的下調，可能通過引起經典Wnt/β-catenin信號通路的激活，導致通路下游靶基因的過度表達，伴隨細胞過度的增殖和失控的分化從而引起腫瘤的發生。表觀遺傳學改變如基因5′端CpG島甲基化是Wif-1基因失活的重要機制。已有一系列研究證實在各系統腫瘤中，啟動子區甲基化可引起Wif-1基因失活[10-12]。在CRC中，Taniguchi等[13]和Lee等[14]的研究顯示，Wif-1啟動子區的甲基化率都很高，分別為82.0%和74%。齊健等[15]的研究結果與國外基本一致，Wif-1甲基化率為84.7%。Wif-1基因的啟動子中存在T細胞相關因子（T cell factor，TCF）的反應元件[11]，而TCF是目前已知的Wnt通路中重要的核內靶因子，Wnt信號活化可使β-catenin在胞漿內累積并進入核內識別淋巴結增強因子/T細胞相關因子（lymphoid enhancer factor/T cell factor，LEF/TCF）等轉錄因子，激活Wnt信號的靶基因，控制胚胎發育及細胞生長、分化及凋亡等。Kansara等[16]和Chung等[17]的研究結果顯示，Wnt拮抗物的高甲基化可以增加β-catenin在細胞質中的積聚及經典Wnt/β-catenin信號通路的激活。

本實驗研究中筆者采用去甲基化藥物5'-Aza-CdR處理兩個結直腸癌細胞株：MSS細胞株HT-29和MSI細胞株LoVo后通過實時熒光定量PCR檢測，筆者發現DNA層面上DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-Aza-dCR中HT-29細胞株中Wif-1基因甲基化狀態分別為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化，LoVo細胞株中Wif-1基因甲基化狀態都為未甲基化，說明去甲基化藥物5′-Aza-CdR能夠逆轉Wif-1基因甲基化狀態，同時在mRNA層面上筆者發現在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1基因的mRNA表達水平較DMSO對照組上調，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=144.823，P=0.000），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有統計學意義（t=6.945，P=0.020；t=41.629，P=0.001；t=14.262，P=0.005）；LoVo細胞株中Wif-1基因的mRNA表達水平較DMSO對照組上調，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=476.195，P=0.000），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有高度統計學意義（t=10.656，P=0.009；t=25.486，P=0.002；t=51.323，P=0.000）。最后通過Western blot在蛋白層面上發現在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1蛋白表達水平較DMSO對照組上調，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=129.674，P=0.000），與DMSO對照組比較，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組比較，差異均有統計學意義（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo細胞株中Wif-1基因的蛋白表達水平較DMSO對照組略微上調，并且有藥物濃度依賴性但差異無統計學意義（F=0.117，P=0.948），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組差異均有高度統計學意義（t=19.414，P=0.003；t=30.468，P=0.001；t=102.233，P=0.000）。

本實驗研究顯示甲基化酶抑制劑5′-aza-dC可通過啟動子甲基化而失活的Wif-1基因的異常甲基化狀態得到逆轉，而使該抑癌基因恢復其轉錄活性，以使該基因在腫瘤的發生發展中發揮可能的抑制腫瘤的作用。腫瘤的發生發展涉及多種途徑和多種基因的改變，其中表觀遺傳學的變化逐漸受到醫學研究的重視。異常甲基化是表觀遺傳學研究的一個重要內容，往往是導致抑癌基因失活的主要原因。本研究希望能通過對異常甲基化的進一步研究，來尋求結直腸腫瘤診斷的新標志物和治療的新靶點。

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（收稿日期：2014-02-11 本文編輯：衛 軻）