PI3K/AKT及MEK/ERK信號通路抑制劑對結直腸癌血管內皮細胞管道形成的作用

郝志楠 鄭勇斌 肖高春 李盛波

武漢大學人民醫院胃腸外科，湖北武漢430060

PI3K/AKT及MEK/ERK信號通路抑制劑對結直腸癌血管內皮細胞管道形成的作用

郝志楠 鄭勇斌 肖高春 李盛波

武漢大學人民醫院胃腸外科，湖北武漢430060

目的探討PI3K/AKT信號通路抑制劑（LY294002）及MEK/ERK信號通路抑制劑（PD98059）對結直腸癌血管內皮細胞管道形成的影響。方法實驗分為對照組和實驗組，其中對照組分正常組和二甲基亞砜（DMSO）組（0.1%DMSO），實驗組分PI3K/AKT信號通路抑制劑組LY294002及MEK/ERK信號通路抑制劑組PD98059（實驗組設4個濃度梯度），比較結直腸癌血管內皮細胞在不同抑制劑濃度（2.5、5、10、20μmol/L）作用下在Matrigel膠上管道形成的情況，6 h后觀察并取每個孔上、下、左、右、中5個區域中的圖片，測其管道形成的總長度，每組均設3個復孔，數據以均數±標準差表示，采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。結果對照組中正常組與DMSO組兩者管道形成總長度之間差異無統計學意義[（4.16±0.26）mm比（4.17±0.18）mm]，而實驗組管道形成總長度較對照組都有明顯減少（P＜0.05）。其中LY294002濃度在2.5、5、10、20μmol/L管道形成的長度分別為（3.08±0.51）、（2.65±0.24）、（2.02±0.18）、（1.08±0.13）mm，而PD98059管道形成的長度分別為（3.39± 0.18）、（2.98±0.12）、（2.53±0.18）、（1.88±0.12）mm，隨著濃度的增加，管道形成長度逐漸減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。LY294002與PD98059相比，在相同濃度下，LY294002管道形成長度較PD98059減少（P＜0.05）。結論PI3K/AKT信號通路抑制劑及ERK/MEK信號通路抑制劑能夠明顯抑制結直腸癌血管內皮細胞的管道形成，且隨著抑制劑濃度的升高，管道形成能力進一步降低，PI3K/AKT信號通路抑制劑抑制腫瘤血管內皮細胞管道形成的能力比ERK/MEK信號通路抑制劑明顯。

PI3K/AKT抑制劑（LY294002）；ERK/MEK抑制劑（PD98059）；結直腸癌血管內皮細胞；管道形成

腫瘤侵襲和轉移是多階段、多基因參與的過程，轉移相關基因的調節涉及復雜的機制及多條信號傳導途徑，目前研究的熱點主要集中在細胞信號傳導通路與惡性腫瘤的關系[1-4]，細胞信號傳導通路在惡性腫瘤形成和發展中多個環節具有重要的作用，其中血管形成在惡性腫瘤的生成和轉移中最重要，腫瘤的生長和轉移需要有新生血管的形成，如果沒有血管新生，腫瘤生長不會超過1～2 cm，當實體腫瘤生長達到一定程度時，進一步生長就有依賴于新生血管的形成來提供腫瘤生長所需的氧和其他營養物質[5]，腫瘤血管新生是由于腫瘤細胞分泌促血管生成因子，這些分子可能產生于腫瘤細胞或周圍基質細胞，進而激活內皮細胞，激活的內皮細胞降解其基底膜，內皮細胞遷移、擴增、形成血管，腫瘤血管的形成類似于胚胎血管發育的過程，它是一項復雜精密的工程，各種信號途徑在血管發育中起著重要的作用，信號通路在生理性及病理性血管生成中發揮重要的調控作用，可以直接影響血管重構、血管穩定性、血管平滑肌細胞的分化，動靜脈發生選擇等，細胞受體接收外界信號到最后做出綜合性應答，不僅是一個信號轉導過程，更重要的是將外界信號進行逐步放大的過程。健康時血管增生處于嚴格控制之下并僅發生在胚胎發育、子宮內膜調節和傷口修復時，但在許多病理情況下如腫瘤、類風濕性關節炎、動脈硬化等，血管形成的持續失控狀態驅動疾病的惡化，腫瘤的生長與轉移依賴血管生成建立豐富的血液循環，以供應腫瘤組織異常旺盛的生化代謝以及瘤細胞的繁殖與轉移。在腫瘤血管新生中內皮細胞遷移、相互融合并形成管狀結構是血管形成過程中的重要環節，如能抑制這一環節，就可對腫瘤的血管形成起到抑制作用，因此抑制腫瘤的新生血管就可以抑制腫瘤的生長，血管生成抑制劑的研究逐漸成為腫瘤研究的熱點和腫瘤治療的新策略。血管生成抑制劑可能提高傳統化療、放療的療效，腫瘤消退期的患者應用血管生成抑制劑有可能使微小轉移處于靜息狀態，從而控制腫瘤的轉移和復發。PI3K/AKT信號通路中的p110亞單位不僅能夠調節內皮細胞的遷移和屏障功能，同時對血管形成也有重要作用。此外，血管內皮細胞中的ras基因持續活化能直接調節PI3K信號通路，來誘導腫瘤血管畸變；MEK/ERK信號通路是將細胞表面受體信號轉導至細胞核的關鍵，控制著細胞多種生理過程，參入細胞的增殖、遷移與分化、細胞形態的維持、細胞骨架的構建、細胞凋亡和細胞惡變等多種生物學反應。PI3K/AKT信號通路和MEK/ERK信號通路是2個比較重要的信號通路，為了研究它對腫瘤血管形成的影響，本實驗以結腸癌細胞SW480為例，觀察PI3K/AKT信號通路抑制劑及MEK/ERK信號通路抑制劑對腫瘤血管內皮細胞管道形成長度的影響，以此評估其血管新生程度，從而探索信號通路抑制劑在腫瘤血管新生的作用，為腫瘤的治療和預防提供一種新的輔助治療手段。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人結腸癌細胞系SW480（武漢大學保藏中心）、人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）來自武漢大學消化實驗室保存，PD98059，LY294002購自碧云天公司，胎牛血清購自個Gibco公司，DMEM-F12培養基購自Hyclone公司，細胞培養瓶，培養板，Matrigel膠膠購自BD公司，倒置相差顯微鏡日本Olympus。

1.2 主要實驗材料和儀器

CO2恒溫培養箱、倒置相差顯微鏡、超凈工作臺、37℃恒溫烤箱等。

1.3 腫瘤血管內皮細胞的誘導

人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）自液氮中取出后，即放于37℃水浴箱中，震蕩復融20～60 s，待管中內容物完全溶解，把細胞懸液加入10mL離心管，再緩慢加入8 mL 10%的胎牛血清完全培養液，1000 r/min，3 min離心后棄上清，加入適量培養基溶解沉淀細胞，移入25 mL培養瓶內，置37℃、5%CO2培養箱內培養，2～3 d換液1次，當細胞融合到80%左右時傳代培養。SW 480細胞用含10%的DMEM-F12培養，當細胞融合達到80%的時候換為無血清的DMEM-F12培養液，0.22μm的濾膜過濾，-80℃保存備用。用含體積分數為50%的SW480細胞上清DMEM-F12培養48 h，當融合至80%時收集細胞，即為腫瘤血管內皮細胞（Td-EC）[6]，該細胞具有結腸癌腫瘤細胞活性的腫瘤內皮細胞，當Td-EC處于對數生長期時，用于做管道形成試驗。

1.4 細胞的同步化

采取血清饑餓法[7]，用無血清培養基同步化Td-EC 24 h，使不同細胞同步于G0～G1期，實驗前24 h將對數生長期的Td-EC用無血清培養基同步化，便于對實驗結果的分析。

1.5 藥物濃度的準備

公司提供PI3K抑制劑LY294002及MEK抑制劑PD 98059用無血清培養基將其稀釋為濃度2.5、5、10、20μmol/L供實驗時使用。二甲基亞砜（DMSO），分子量為78.13，將其用無血清培養基稀釋為0.1%DMSO，供實驗時使用。

1.6 管道形成實驗

采用BD公司Matrigel膠，使用前應從-20℃轉移至4℃待其自然溶化（如過夜放置），同時將實驗需要與Matrigel膠接觸的96孔板、200μL移液吸頭均應預冷于4℃，鋪膠所有過程均在冰上操作。在96孔板的每個孔內緩慢加入50μL BD Matrigel膠，不稀釋。小心搖動使膠分布在孔的各個部位，避免產生氣泡，同時在冰上靜止5 min，使膠能夠鋪平，然后將96孔板水平輕輕放入5%CO2、37℃細胞培養箱中1 h，使用前需用無血清培養基輕洗Matrigel膠，水化基底膜。鋪膠完畢后，應用細胞計數法計算細胞濃度，方法是用血細胞計數板計數細胞懸液中的細胞數目，以測定細胞增殖的狀態和調整接種細胞濃度。消化法計數同步化細胞使其濃度為3×105個/mL，取100μL即含3×104個細胞，離心后棄上清，按照實驗設計要求，分為對照組、實驗組，實驗組根據抑制劑濃度的不同分為2.5、5、10、20μmol/L，將已配好濃度的液體分別加入離心后的細胞中，充分混勻后加入96孔板中，將96孔板放入CO2、37℃恒溫培養箱中培養。6 h后在倒置相差顯微鏡（10×20）下觀察，并采集圖像，每個孔取上、下、左、右、中5個區域.每個區域隨機取一張圖片，通過實驗室中奧林巴斯倒置相差顯微鏡中的cellsens standard軟件對每張圖片進行測量，測出每張圖片上管道形成的總長度（單位mm），每個實驗均設3個復孔，每組有15個數據。

1.7 統計學方法

采用統計軟件SPSS 16.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，各組數據比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PI3K/AKT信號通路抑制劑對結直腸癌血管內皮細胞管道形成的結果

采用單因素方差分析比較，對照組中結直腸癌血管內皮細胞在Matrigel基質膠上形成管道狀結構，逐漸相連呈網狀，而實驗組形成的管道長度較對照組均減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；q檢驗比較結果顯示，隨著抑制劑濃度增高，各組管道形成總長度逐漸減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。圖1結果顯示，對照組中的正常組和0.1%DMSO組即開始由原來的多角形變成長梭形，并向Matrigel基質膠中延伸生長，而后呈線形排列成管狀結構，6 h后多個管狀結構相互連接形成三維網狀結構；而在2.5μmol/L組可以看到一定數量的管腔結構，大部分為數量較長的線狀結構，在5μmol/L組中的管腔結構較2.5μmol/L組有所減少，多為線性結構，在10μmol/L組和20μmol/L組中基本上看不到管腔形成，10μmol/L組可見看到較多內皮細胞組成的線形結構，而在20μmol/L組中看到的內皮細胞皮細胞均為圓形，基本上無線性結構。

表1 LY294002對結直腸癌血管內皮細胞管道形成的影響

2.2 ERK/MEK信號通路抑制劑對結直腸癌血管內皮細胞管道形成的結果

方差分析結果顯示，不同濃度PD98059作用結直腸癌血管內皮細胞6 h后形成管腔結構情況是不同的，各組間差異有統計學意義（P＜0.05），提示隨著PD98059濃度的增高，管道形成長度逐漸減少，見表2。由圖2可見，在濃度為20μmol/L時，看不到管腔結構，有少量較短的內皮細胞連接在一起的線狀結構，多數為單個的圓形內皮細胞，而在10μmol/L時，線狀結構較20μmol/L數量多一些，在5μmol/L時可以看到少量的管腔結構，2.5μmol/L時可以看到多一些管腔結構，連接成三維網狀，對照組可見多個管狀結構相互連接形成三維網狀結構。

2.3 PI3K/AKT信號通路抑制劑及ERK/MEK信號通路抑制劑管道形成之間比較

LY294002及PD98059抑制劑均能顯著抑制腫瘤內皮細胞管道形成。表3顯示在相同抑制劑濃度作用下，其間管道形成的長度不同，差異有統計學意義（P＜0.05），由此可以說明LY294002對腫瘤血管內皮細胞管道形成的抑制作用較PD98059強。見表3。

圖1 PI3K/AKT信號通路抑制劑（LY294002）對結直腸癌血管內皮細胞管道形成的影響（200×）

圖2 ERK/MEK信號通路抑制劑（PD98059）對結直腸癌血管內皮細胞管道形成的影響（200×）

表2 PD98059對結直腸癌血管內皮細胞管道形成的影響

表3 不同濃度LY294002及PD98059作用下結直腸血管內皮細胞管道長度（mm±s）

表3 不同濃度LY294002及PD98059作用下結直腸血管內皮細胞管道長度（mm±s）

抑制劑濃度LY294002 PD98059 P值2.5μmol/L 5μmol/L 10μmol/L 20μmol/L 3.08±0.51 2.65±0.24 2.02±0.18 1.08±0.13 3.39±0.18 2.98±0.12 2.53±0.18 1.88±0.12＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

3 討論

結直腸癌是我國目前常見的惡性腫瘤之一，它的生長可分為兩個時期即無血管期和血管期，無血管期的腫瘤細胞主要依靠擴散作用進行物質交換，腫瘤生長緩慢，腫瘤的營養供給及代謝物排泄僅能靠簡單的物理彌散，但隨著腫瘤細胞的不斷增殖，擴散作用不能滿足腫瘤細胞進一步增長的需要，腫瘤將啟動血管生成這一復雜過程，新生血管為腫瘤提供豐富的血液灌注和充足的營養物質，在良好的生長環境下，腫瘤組織迅速生長，它是腫瘤細胞代謝產物排泄的有效途徑，它也是腫瘤細胞向遠處轉移的重要通道，腫瘤細胞通過血管才能到達轉移地點[8]。體內的血管新生是由于惡性腫瘤自身分泌許多促進血管新生因子[9]而轉向促血管新生，內皮細胞的增生、移動、管道形成是血管生成所必需的步驟，腫瘤血管生成是導致腫瘤從“良性休眠”的無血管期狀態過渡到“惡性瘋長”的血管期狀態的關鍵[10]。有學者研究Notch信號通路途徑在血管發育的過程中起著重要作用，可以直接影響血管重構、血管穩定性、血管平滑肌細胞的分化、動靜脈發生選擇等[11-12]。

本實驗選用的信號通路抑制劑是PI3K/AKT及ERK/MEK信號通路抑制劑。其中PI3K/AKT信號通路控制著眾多在腫瘤發生發展中至關重要的細胞生物學過程，包括細胞凋亡、轉錄、翻譯、代謝、血管生成以及細胞周期的調控[13]，PI3K是AKT/mTOR通路的上游分子，其異常激活可以引起一系列的反應，包括細胞的生長、增殖和轉移、上皮細胞向間葉細胞的轉變以及血管的生成，PI3K/AKT信號通路的激活能活化AKT，AKT又稱蛋白激酶B，是一類調節細胞凋亡與存活的胞漿信號轉導蛋白，生理狀態下，AKT以低活性（失活狀態）存在于細胞漿，當各種外因刺激時，AKT在三磷酸酰肌醇蛋白激酶作用下發生磷酸化而激活[14-15]，在胃腸道腫瘤、胰腺癌等組織中AKT均高表達及活化，AKT信號通路的激活在腫瘤的發生、發展過程中起重要的紐帶作用，體內許多腫瘤發生均與該通路異常激活密切相關，而活化的AKT通過磷酸化作用激活或抑制多種底物來調節細胞功能，包括細胞代謝、蛋白質合成、細胞凋亡、細胞周期進程，進而調節細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等[16-17]。內皮細胞一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）是調節血管生成和血管張力的重要因子。內皮細胞體外培養表明：轉染IGF-1和VEGF可以通過PI3K通路誘導eNOS的合成，其活性磷酸化序列為RIRTQS（1177）F；AKT可以和eNOS共定位于細胞膜、并使Ser1177磷酸化；而PI3K抑制劑可以降低AKT的活性和Ser1177的磷酸化水平[18]，另外一項研究表明：PI3K抑制劑可以阻斷雌二醇介導的eNOS釋放，而雌二醇可以刺激AKT的活性和eNOS的磷酸化水平[19]。研究發現人類的多種腫瘤如胃癌、大腸癌、乳腺癌、肝癌、腎癌等均與PI3K/AKT信號通路密切相關，且PI3K/AKT信號通路中多種上下游分子的改變均可影響腫瘤的發生和發展，信號通路可從凋亡、炎性反應、免疫等多方面影響腫瘤的發生和發展。其靶向抑制劑不僅能減少VEGF的分泌，還可抑制血管形成，該通路具有重要的臨床意義[20]，其中LY294002[21]是PI3K-AKT信號通路抑制劑最經典的抑制劑，具有靶向抑制PDK催化亞基pl10的作用，從而抑制腫瘤生長及腫瘤血管形成[22]。

ERK/MEK信號通路中有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）是細胞內重要的信號傳導通路，需被細胞因子激活后才起作用，多種腫瘤或增殖性疾病與其有關[23]，具有調控機體細胞的增殖、分化、轉化及凋亡等多種功能，細胞外信號調節激酶（ERK）通路是其中重要的傳導通路，MEK是其中的重要一環，PD98059是一種特異性的MEK抑制劑，通過與MEKl/2的非活化形式結合阻止其磷酸化，進而抑制ERKl/2的磷酸化而阻斷細胞信號轉導，它幾乎可以抑制所有ERK亞族的活性，從而抑制腫瘤細胞的增殖[24]。PD98059是選擇性的細胞內MAPK傳導通路的特異抑制劑，能夠抑制ERK的上游激酶MAPK激酶（MEK），理論上能夠阻斷增殖信號的傳遞，從而抑制腫瘤細胞的生長。

本實驗所采用的BD公司Matrigel膠，它是從富含胞外基質蛋白的EHS小鼠腫瘤中提取出基底膜基質，其主要成分有層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，還包含生長因子和基質金屬蛋白酶等。在室溫條件下，Matrigel聚合形成具有生物學活性的三維基質，模擬體內細胞基底膜的結構、組成、物理特性和功能。通過實驗結果看，對照組中TD-EC在Matrigel基質膠上形成管道結構，逐漸相連呈網狀，兩者之間差異無統計學意義（P＞0.05），DMSO是兩種抑制劑LY294002及PD98059的初始溶劑。因此，檢測DMSO組與正常組之間TD-EC管道形成能力有無差別，實驗發現兩者之間管道形成無任何差別，說明小劑量DMSO作為LY294002、PD98059的溶劑不影響腫瘤血管內皮細胞的管道形成能力，隨著抑制劑濃度的增高，管道形成長度逐漸減少，經過統計學分析其間差異有統計學意義（P＜0.05）。兩種抑制劑之間相互比較發現，LY294002對腫瘤血管內皮細胞管道形成的抑制作用較PD98059強。

為了進一步早期抑制腫瘤發生，有必要對結直腸癌疾病進行深入研究，以明確結直腸癌危險因素和切實其病因從而采取有效的防治措施，減少結直腸癌的發病率。本研究通過兩種不同的信號通路抑制劑LY294002及PD98059檢測對腫瘤血管內皮細胞管道形成的影響，使其有可能成為抑制腫瘤生長的潛在治療靶點。P13K/AKT信號通路及MEK/ERK信號通路在腫瘤血管的發生發展過程中發揮重要作用，尤其是其抑制劑在腫瘤靶向治療方面的研究已取得可喜的進展，但因信號通路內的關系錯綜復雜，目前抗腫瘤的研究多局限于單一靶向治療，但其具體機制及與其他信號途徑之間的相互影響、相互聯系尚不完全清楚，如多種信號通路聯合使用能否更加有效抑制管道形成，其相關實驗需進一步證實。本實驗中PI3K/Akt及ERK/MEK信號通路抑制劑能夠顯著抑制腫瘤內皮細胞小管形成，從而抑制腫瘤血管新生，為今后在腫瘤的臨床監測、基因靶向治療、預后評估、藥物療效及新藥研發等提供科學的實驗依據。

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The role of PI3K/AKT and ERK/MEK signaling pathway inhibitors on colorectal cancer vascular endothelial cells in tube formationing

HAO Zhinan ZHENG Yongbin XIAO Gaochun LIShengbo
Department of Gastrointestinal Surgery,Renmin Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China

Objective To study of the effect of PI3K/AKT and ERK/MEK signaling pathway inhibitors on colorectal cancer vascular endothelial cells in tube formationing.M ethods The experiment were divided into control group and experiment group,the control group was divided into the normal group and the 0.1%DMSO group,and experiment group was divided into PI3K/AKT signaling pathway inhibitors groups LY294002 and ERK/MEK signaling pathway inhibitors group PD98059(each group had 4 concentration gradients).Those pipe formation in different inhibitor concentration degree(2.5,5,10,20μmol/L)were compared,and its inhibitory effects on thismicro-vascular forming ability by counting the total length the pictures come from upper,lower,left,right of the tubes formed after six hours were detected.In each hole,each group had three samples,all data were epressed by mean standard deviation,and SPSS16.0 software to conduct statistical analysis was used,it had statistical significance when P＜0.05.Results The length of tubule formation between normalgroup and DMSO group had no difference[(4.16±0.26)mm vs(4.17±0.18)mm], and the experiment group tubule formation had decreased significantly compared to control group(P＜0.05).The length of the pipe forming were(3.08±0.51),(2.65±0.24),(2.02±0.18),(1.08±0.13)mm,when LY294002 concentration were 2.5,5,10,20μmol/L,and PD98059 were(3.39±0.18), (2.98±0.12),(2.53±0.18),(1.88±0.12)mm,with the increase of concentration,pipe forming length gradually reduced,there were statistical significances(P＜0.05). Comparedwith PD98059,the pipe forming of LY294002decreased under the same concentration(P＜0.05).Conclusion PI3K/AKT and ERK/MEK signal pathway inhibitors can inhibit tube formation from colorectal cancer vascular endothelial cells,with the increasing inhibitor concentration, tube formation ability decreased further.PI3K/AKT signaling pathway inhibitors is obvious in inhibit piping formation ability than the MEK/ERK signaling pathway inhibitor.

PI3K/AKT inhibitors(LY294002);ERK/MEK inhibitors(PD98059);Tumor vascular endothelial cells; Tube formation

R587.1

A

1673-7210（2014）08（b）-0030-06

2014-04-01本文編輯：衛軻）

國家自然科學基金（編號81372553）。

郝志楠（1982.11-），男，湖北十堰人，武漢大學人民醫院2012級胃腸外科專業在讀碩士研究生。

鄭勇斌（1970.10-），男，湖北監利人，博士，副主任醫師；研究方向：胃腸道腫瘤。