Calretinin基因在先天性巨結腸腸壁中的表達及意義

馬能強，陳琦，李勇，龔晟

Calretinin基因在先天性巨結腸腸壁中的表達及意義

馬能強，陳琦，李勇，龔晟

目的分析Calretinin（CR）基因在先天性巨結腸（HD）中的表達情況，探討其在HD中的意義。方法采用RTPCR技術檢測18例對照組患兒結腸和HD患兒痙攣段、擴張段結腸腸壁中CR基因的表達，計算其相對量并進行比較分析。結果HD痙攣段和HD擴張段CR基因表達的相對量分別為0.14±0.10和0.57±0.09，對照組為0.82±0.09；3 組CR基因表達的相對系數比較差異有統計學意義（＜0.01），3組兩兩比較差異均有統計學意義（均＜0.01）。結論CR基因在HD患兒腸管中表達水平下調可能與散發性HD的發生關系密切，其可能參與了HD的發生。

兒童；先天性巨結腸；Calretinin基因

鈣離子（Ca2+）是細胞內重要的第二信使，它參與一系列神經細胞生理活動，對神經細胞的代謝和功能產生廣泛的影響。細胞內自由Ca2+濃度的維持對細胞來說非常重要，Ca2+的維持靠各種鈣泵和鈣結合蛋白（CaBP），鈣結合蛋白在此過程中發揮重要的介導調節作用。鈣視網膜蛋白（CR）是其中較重要的一種，關于CR基因生物化學及細胞生物學的研究報道較少，是否與先天性巨結腸（HD）的發生有關聯，其具體功能怎樣，通過什么途徑如何對HD的發生、發展進行調節，目前尚不甚清楚。國外有研究發現在HD患者無神經節細胞腸段CR缺失[1]，認為CR基因與HD的發病有關。筆者觀察CR基因在HD患兒結腸腸壁中表達情況，旨在探討HD的發生機制。現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集鄭州大學第三附屬醫院2007年4月至2012年6月間經臨床確診的、并術后病理切片證實的散發性HD腸管組織標本18份（患兒18例）作為實驗組，其中男14例，女4例；年齡0.5～49個月，平均（5.3±1.1）個月；長段型2例，常見型8例，短段型8例。HD術前診斷依病史、體征、鋇劑灌腸造影檢查、直腸黏膜活檢綜合判斷確診，鋇劑灌腸顯示痙攣段及其上的擴張段，直腸黏膜活檢HE染色顯示痙攣段缺乏神經節細胞。術后經有經驗病理科醫師二次證實痙攣段無神經節細胞。對照組選取年齡相似的非HD患兒，如腸套疊、美克耳憩室、結腸穿孔等18例手術切除之結腸標本作對照組，患兒均無合并HD，家族中也沒也沒有HD家族史。對照組18例，其中男12例，女6例；年齡2～62個月，平均（8.5±1.7）個月。實驗組和對照組間性別和年齡差異均無統計學意義（均＞0.05）。

1.2 主要試劑AMV一步法RT-PCR試劑盒購自上海生物工程技術服務有限公司，DNAmaker由寶生物工程（大連）有限公司提供，Trizol總RNA提取試劑為美國invitrogen公司產品。引物由GenBank查知CR基因全序列，由北京奧科生物技術有限責任公司合成部設計并合成CR基因和-actin基因引物序列。引物序列見表1。余試劑均由鄭州大學基礎醫學院病理實驗室提供，本實驗亦在上實驗室完成。

1.3 方法

1.3.1 病例標本的處理和保存手術中分別取HD患兒痙攣段（實驗痙攣組）、擴張段（實驗擴張組）近端以及對照組患兒新鮮結腸標本，0.9%氯化鈉注射液沖洗后去掉黏膜層和漿膜層的纖維組織，放入標記好的經DEPC處理過的凍存管中，立即用便攜式液氮罐運至實驗室，置－86℃低溫冰箱保存，待所有標本收集后一起檢測。

1.3.2 RT-PCR檢測3組標本中各結腸腸壁中CR mRNA情況

1.3.2.1 組織總RNA的提取擴增先按試劑盒說明提取組織內總RNA并行純度鑒定：用DEPC水將提取的總RNA稀釋1000倍，紫外分光光度儀測260 nm 和280 nm波長的吸光度，即OD260和OD280，測得OD260/OD280在1.8～2.0。表示提取的RNA純度高，蛋白質污染少，所得RNA可以用來逆轉錄和擴增。然后按RT-PCR試劑盒提供的反應條件逐步加入試劑。

1.3.2.2 瓊脂糖凝膠電泳和圖像分析取擴增產物或DNA maker 5ul、6×加樣緩沖液1 l、溴酚蘭1l充分混勻，加入1%瓊脂糖凝膠上樣孔中電泳20～30min。凝膠圖像分析系統觀察電泳結果并拍照、行灰度掃描，出現明亮的特異條帶者，收集保存于－20℃冰箱。應用圖像分析軟件作半定量分析，以CR/-actin灰度值之比表示CR表達的相對量，以減少誤差。

1.4 統計方法采用SPSS16.0統計軟件進行統計學處理，計量資料采用均數±標準差表示，3組間比較采用檢驗，兩兩比較采用LSD-檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 內參-actin在各段結腸壁中的表達情況內參-actin產物大小為385bp，DNAmaker單位為100 bp，電泳結果顯示，在各段腸壁中-actin均穩定表達，條帶清晰（封三彩圖6）。

2.2 對照組和散發性HD患兒各段結腸腸壁中CR基因mRNA的表達情況CR基因mRNART-PCR產物為231 bp，其電泳結果示，與正常對照組相比，HD

擴張段、HD痙攣段CR基因mRNA的相對量逐漸減少，在HD痙攣段未見明顯表達。3組CR基因表達的相對系數比較差異有統計學意義（=37.16，＜0.01），3組兩兩比較差異均有統計學意義（均＜0.01）。見表2和封三彩圖7。

3 討論

HD最基本的病理特點是病變腸管的肌間神經叢及黏膜下神經叢中神經節細胞缺如，以及異常增生的神經纖維，累及范圍從腸管某段開始直到直腸肛門。其病因和發病機制尚未完全闡明，目前認為，HD發病是多個基因或易感位點共同作用或相互交叉影響的結果，其中RET/GDNF以及EDN-3/EDNRB/ECE-1這兩個信號通路的研究最為廣泛，任何一個信息通路傳導障礙均會引起患兒胚胎期神經嵴細胞的移行、發育、分化異常，發生神經節細胞的缺失，導致HD的發生。RET、EDNRB、EDN3基因作為以上兩個通路系統的核心基因，是目前研究HD發病機制的重點。RET基因信號通路障礙主要引起家族性巨結腸，RET突變能解釋50%的家族性HD，但只能解釋15%～20%的散發性HD[2]，而EDN-3基因信號通路系統異常主要表現在散發性HD。和RET基因突變不一樣，EDN-3或EDNRB基因的變異在長段型HD中并不常見。EDNRB基因剔除試驗制成的鼠，其消化道的結構大體正常，結腸的損害是短段腸壁內無神經節細胞，而不是全部結腸，所以說EDN-3通路系統的異常更加接近于臨床上的HD。當EDN-3與EDNRB受體蛋白結合后，可將細胞外的信號級聯性放大并傳入細胞內，引起細胞內鈣離子濃度的改變，并激活腺苷酸環化酶，對腸神經節細胞的發育具有重要作用[3]。CR是一種鈣結合蛋白，最近發現在腸神經系統中廣泛存在，主要作用是調節細胞內Ca2+濃度，防止細胞內自由Ca2+的急驟增高引起的神經細胞興奮性中毒損傷[4-5]，具有神經保護作用。2004年Barshack等[1]研究10例HD患者的直腸乙狀結腸全厚切片（共54個固體石蠟），發現在HD患者無神經節細胞腸段CR表達缺失，認為CR基因的變異或表達異常與HD的發病有關聯。2009 年Kapur等[6]研究14例HD患者和17例對照組直腸活檢，發現CR免疫組化反應比直腸乙酰膽堿脂酶組織化學檢查在診斷HD上更能減少誤診率。

本文研究18例對照組和18例散發性HD患兒各段結腸腸壁中CR基因mRNA的表達情況，發現在散發性HD患兒結腸標本中，不論是有神經節細胞段還是無神經節細胞段，CR基因mRNA的平均相對系數均少于對照組，在HD痙攣段尤其明顯；這說明，CR的表達的降低或缺失可能參與散發性HD的發生，其可能機制是：（1）CR的減少或缺失使神經細胞胞內瞬間Ca2+緩沖能力下降，導致神經細胞受損發生凋亡所致。（2）CR可能參與RET/GDNF以及EDN-3/EDNRB/ECE-1這兩個信號通路的調節。Kjaer等[7]研究證明，RET胞外鈣粘蛋白結合域可直接與Ca2+結合，RET配基復合體的形成必須有Ca2+的參與，細胞外Ca2+缺乏使RET加工和插入質膜的過程受阻；McCallion等[3]研究顯示當EDN-3與其跨膜蛋白配體EDNRB結合后，可以調節細胞內鈣離子濃度，引起細胞的收縮和分泌。（3）CR還可通過調節基因表達影響其他HD發生的相關因子，CR不僅存在于細胞質中，且部分存在細胞核內，核內CR還可作為鈣信使調節基因轉錄[8-9]。如：神經膜上Ca2+通道開放使胞漿中游離的Ca2+濃度迅速升高，刺激誘導c-fos基因異常表達。有研究發現c-fos基因參與神經細胞的生長、分化和信息傳遞等生理過程，與神經細胞的功能和結構損害有著密切關系[10]。已有研究發現，C-fos基因過度表達可促進HD神經節細胞的損害，導致HD的發生[11]。綜上，可以認為CR可能通過共同調節細胞內鈣離子濃度，從而影響腸道神經嵴細胞的分化、發育、成熟及定居，在HD發病中起到一定的作用。

表1 CR和-actin引物序列特征

表2 各段結腸腸壁中CR基因表達的平均相對量

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.08.044

R725.7

A

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