改良骨髓脫鈣液對免疫組化染色結果的影響

夏朝霞

改良骨髓脫鈣液對免疫組化染色結果的影響

夏朝霞

目的探討酸脫鈣液對骨髓活檢組織免疫組化染色的影響。方法對445例骨髓活檢組織經混合酸脫鈣及EDTA雙重脫鈣固定、免疫組化染色。結果組織結構、細胞形態清晰完整，免疫組化染色定位準確、背景清晰。結論混合脫鈣液與EDTA聯合應用有助于免疫組化染色，是骨髓活檢病理診斷的有效方法。

骨髓；脫鈣；脫鈣液；免疫組織化學

骨髓活檢（BMB）技術在骨髓制片診斷中越來越具有優越性，但骨髓組織含有大量礦化物質，給制片造成很大難度，而且骨髓本是各種細胞的發源地，細胞種類和形態極為豐富僅有常規制片診斷難度極大，因而必須結合免疫組化染

色以利于準確診斷。而傳統脫鈣液在脫鈣的同時往往造成組織細胞形態改變及免疫抗原的破壞、丟失影響免疫組化結果[1]。故而筆者結合骨髓組織學特點調整脫鈣液配方及方法，以改善制片質量及免疫表型的表達。報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料選取寧波病理中心2011年7月至2013年4月骨髓活檢標本445例。1.2試劑（1）脫鈣液A：4%～5%甲酸20ml；4%甲醛40ml；冰乙酸5ml；1%濃鹽酸15 ml；氧化鋁6 g，加0.9%氯化鈉注射液至400 ml。（2）脫鈣固定液B：pH 8.0的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液用1molHCL調至pH 7.2，再加入4%甲醛15 ml。（3）免疫組化試劑：一抗及二抗均購自DAKO公司。

1.3 方法（1）組織脫鈣：組織至脫鈣液A中3h，沖洗1h后在進入脫鈣固定液B 中2h。取出后與常規小組織一起脫水、透明、浸蠟，常規包埋。（2）免疫組化染色：①切片脫蠟至水。②按抗體需要修復（酶消化或熱修復），PBS沖洗2 min×3。③3% H2O2室溫孵育15～20 min，PBS沖洗2 min×3。④滴加一抗37℃孵育60 min，PBS沖洗2min×3。⑤滴加二抗37℃孵育15 min，PBS沖洗2 min×3。⑥DAB鏡下顯色，蘇木素復染，脫水，封片。

2 結果

骨髓組織脫鈣效果良好，組織學結構和細胞輪廓清晰完整。切片免疫組化染色定位準確，染色背景清晰，無非特異性著色。見封四彩圖3～4。

3 討論

BMB在骨髓增生性腫瘤（MPN）中的原發性骨髓纖維化、原發性血小板增多癥、慢性嗜酸粒細胞白血病、慢性粒細胞白血病急性變、肥大細胞增生癥及骨髓轉移瘤等的診斷與鑒別診斷中尤其具有獨到的優勢，平均符合率約為94%[1]。而BMB免疫組化輔助診斷使得骨髓病理診斷及臨床預后更具積極意義。但骨髓酸脫鈣處理或多或少地降低了組織免疫組化染色的敏感性[2]。如何使脫鈣液既能有效脫鈣制片又最大程度的保留抗原的完整性，利于免疫組化染色是骨髓制片技術的研究方向。

脫鈣的目的是脫去骨基質中的羥基磷灰石（HAP）同時不破壞組織細胞形態，不損傷細胞大分子物質丟失抗原。傳統脫鈣液如硝酸，屬強酸在脫鈣過程中產生二氧化碳氣泡可引起組織變形，而且組織酸化易使HE染色時細胞核染色欠佳[3]。本方法選用混合酸配方及EDTA甲醛液雙重脫鈣、雙重固定。從而在短時間內使組織脫鈣完全快速、組織固定充分、抗原保存良好。本文中的脫鈣液A為復合脫鈣液：4%～5%甲酸（CH2O2）為有機酸又稱蟻酸為一種弱酸。因其性能相對溫和，作用緩慢適用于免疫組化染色[4]。濃鹽酸（CHL）是一種強酸為無機酸，具極強揮發性。可加速脫鈣，但可使組織略收縮，影響核染色。但有報道顯示1%鹽酸短時間浸泡對組織細胞形態和大部分抗原免疫組化染色效果影響不大，背景染色較少[2]。故本文中選用1%鹽酸，減少組織收縮和對染色的影響。4%甲醛（HCHO）為強還原劑，是一種良好的固定劑，在微堿性時還原性更強。0.9%氯化鈉為等滲溶液，pH為中性。加入0.9%氯化鈉不僅可以平衡酸溶液，而且能起到水化甲酸、甲醛的作用，使溶液更具親水性，滲透性更強。而HAP屬極性分子具有親水性，被水化的甲酸、甲醛能更好地與HAP反應。

EDTA有機鹽類為重要的絡合劑，而且EDTA可消除微量金屬導致的酶催化反應中的抑制作用，在蛋白質工程及試驗中可在不影響蛋白質功能的情況下去除干擾離子。故而EDTA為一種理想的利于免疫組化染色的脫鈣液[5]。但EDTA性質溫和，對組織滲透性差，脫鈣時間過長影響診斷及治療[6]。本文使用EDTA再次脫鈣固定，既進一步完善脫鈣固定，減少組織固定不佳抗原破壞和丟失，而造成抗原移位，抗體特異性差，濃度不夠或嚴重交叉反應[7]。又可減少酸對組織的損傷，最大程度的避免由此造成的假陽性或假陰性表達。減少人為因素的干擾才能獲得理想的實驗室數據，最準確的病理診斷。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.08.047

R392.3

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夏朝霞，Email:xiazhaoxia 2009@hotmail.com