煙臺黑豬SLA-I重鏈基因末端生物素修飾及表達

煙臺黑豬SLA-I重鏈基因末端生物素修飾及表達

劉筏 楊金剛 翟曉鑫 董宋鵬 高鳳山
（大連大學生命科學與技術學院，大連 116622）

為構建煙臺黑豬SLA-2重鏈基因偶合生物素化酶BirA底物肽（BirA substrate peptide，BSP）并研究其在pET-28a（+）中的表達，設計煙臺黑豬SLA-2-BSP復合基因引物，PCR擴增煙臺黑豬SLA-2-YTH-BSP復合基因，并克隆至pMD 19-T Simple Vectorp，經酶切鑒定后將SLA-2-YTH-BSP復合基因與表達系統pET-28a（+）鏈接，并轉化到BL21（Rosseta）菌進行誘導表達，SDS-PAGE檢測目的蛋白。表達蛋白經過Ni-NTA親和純化，并經SDS-PAGE檢測蛋白純化效果。PCR結果顯示SLA-2-BSP大小為900 bp，并成功克隆到pMD 19-T Simple Vector，酶切鑒定大小為876 bp，該基因鏈接到 pET-28a（+）并轉化到BL21（Rosseta）菌，經誘導表達和SDS-PAGE檢測目的蛋白的大小為32.4 kD。目的蛋白以包涵體形式存在，純化后蛋白純度達到90%以上。成功構建煙臺黑豬SLA-I重鏈偶合生物素化酶BirA底物肽（BSP）的pET-28a（+）的重組表達系，為下一步的SLA-I類分子四聚體研究鑒定基礎。

煙臺黑豬 SLA-2 重鏈基因 生物素化酶BirA底物肽 純化

四聚體技術是目前國內外研究的熱點，其核心技術就是在主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）I類分子重鏈末端進行生物素修飾，以結合親和素構建四聚體檢測病毒CTL（cytotoxic T lymphocyte）表位，從而放大MHC I-peptide的檢測信號，有利于精確檢測病毒的CTL表位［1］。目前，國內外分別構建了人［2］、鼠［3］、雞［4］等MHC I類分子四聚體，并篩選或證實了多種病毒

CTL表位。然而，目前關于豬MHC I四聚體鏈構建鮮有報道。豬的MHC I類分子也稱為豬白細胞抗原（Swine leukocyte antigen，SLA）I類分子。課題組最近報道了我國荷包豬SLA-I末端生物素化的研究，并在pET-21成功進行了表達，從而開始了我國地方品系豬SLA-I重鏈生物素修飾及表達的研究［5］。由于我國有豐富的地方品系豬資源，有必要開展其他地方品系豬SLA-I的相關研究。煙臺黑豬是我國山東省煙臺地區的優質地方品系豬［6］，其重鏈SLA-I基因已經克隆，并具有特征性［7］。本研究擬在前期研究的基礎上，以國內品系煙臺黑豬SLA-I類分子SLA-2功能基因為研究對象，采用分子克隆和基因工程手段在體外構建我國地方品系豬SLA-2偶合生物素化酶BirA底物肽的重組表達系，并在原核表達系統pET-28a（+）進行表達和純化，為下一步構建SLA-I/肽復合物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

重組質粒SLA-2-YTH01/ pMD 18-T為大連大學分子免疫學實驗室構建保存，克隆載體 pMD 19-T Simple Vector，表達載體pET-28a（+）及菌株Escherichia coli.BL21（Rosseta）來自于中國科學院微生物研究所；Escherichia coliTop10菌株為大連大學分子免疫學實驗室保存。

低分子量蛋白Marker、DL2000 DNA Marker、NdeI、XhoI和DNA純化試劑盒購于大連寶生物公司；IPTG、胰化蛋白胨、甘氨酸酵母提取物、丙烯酰胺氨芐青霉素、過硫酸胺、二甲基甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、三羥甲基氨基甲烷等購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計 煙臺黑豬SLA-I重鏈分子SLA-2四聚體鏈表達引物設計PS-21F：5'-GGAATTCCATA TGGGCCCGCATTCCCTGAGCTATTTC-3'（下劃線部分為NdeI酶切位點）；P21BSPR：5'-AGTCTCGAGTTAACGATGATTCCACACCATTTTCTGTGCATCCAGAATAT GATGCAGGCTGCCGTCCCATCTCAGGGTGAGGGGC-3'（下劃線部分為XhoI酶切位點，斜體部分為BSP序列）。

1.2.2 SLA-2-YTH-BSP 亞克隆 以重組質粒為模板，以PS-21F/P21BSPR為引物對，擴增基因鏈SLA-2-YTH-BSP，PCR條件為94℃，5 min；94℃，30 s；56℃，45 s；72℃，90 s；30個循環，72℃延伸10 min，PCR結束后進行核酸電泳，瓊脂糖凝膠濃度為1.0 %，電泳結束后在凝膠成像儀下檢查PCR擴增產物，然后用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。

回收之后SLA-2-YTH-BSP 產物連接 pMD19-T Simple并轉化大腸桿菌Top10，37℃過夜培養。按照堿裂解法提質粒，酶切篩選陽性克隆并保存菌種，陽性克隆送到生物公司進行測序。

1.2.3 表達載體的構建 將篩選的陽性克隆提質粒，經NdeI、XhoI雙酶切，凝膠純化回收SLA-2-YTHBSP 基因 。將 SLA-2-BSP 與 pET-28a連接，轉化至感受態細胞BL21（Rosseta），涂布到含有卡那霉素的平板中，在37℃培養箱中過夜培養，挑選菌落接種至LB培養基（含卡那），從培養的菌液中提取質粒，經NdeI、XhoI雙酶切篩選陽性質粒，陽性質粒命名為pET-28a（+）/SLA-2-YTH-BSP，見圖1，并送生物公司測序。

圖1 構建pET-28a（+）/SLA-2-YTH-BSP重組質粒

1.2.4 SDS-PAGE檢測SLA-2-YTH-BSP蛋白表達將陽性重組菌 100 μL接種5 mL LB液體培養基，37℃、170 r/min振蕩培養直至OD600在0.4-0.6之

間。加入1 mol / L IPTG 5 μL，誘導5 h后，取菌液1 mL，12 000 r/min，2 min，去上清，菌體經TE溶解并經5×SDS樣品buffer處理，SDS-PAGE測蛋白表達［8］。

1.2.5 SLA-2-YTH-BSP 蛋白純化 SLA-2-YTH-BSP表達蛋白按照文獻報道進行［9］。表達后的SLA-2-YTH-BSP重組菌（Rosseta）按 1%比例接種后擴大培養，IPTG 誘導重組蛋白表達，5 000 r/min，4℃離心收集細胞并洗滌后，冰浴超聲裂解細胞，高速離心后分別取上清和沉淀進行 SDS-PAGE，檢測重組蛋白表達形式。收集包涵體并用 1% Triton X-100洗滌后，用 8 mol/L 尿素溶解，離心收集上清液，透析過夜后，進行 Ni-NTA 親和層析，用 60 mmol/L 咪唑充分洗去雜蛋白后，用 0.3 mol/L 咪唑洗脫目標融合蛋白，SDS-PAGE檢測純化蛋白。

2 結果

2.1 SLA-2-YTP-BSP鏈的PCR擴增

經PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測到一條約900 bp的條帶，與理論設計值898 bp大小相符，見圖2。

圖2 SLA-2-YTH-BSP的PCR擴增結果

2.2 SLA-2-YTP-BSP鏈亞克隆到pMD-19-T Simple Vector

經連接轉化后，挑取單菌落培養，用NdeI、XhoI雙酶切，電泳顯示插入片段約900 bp，與目的片段876 bp相符合，見圖3。

圖3 pMD-19-T Simple Vector/SLA-2-YTP-BSP重組質粒雙酶切鑒定

2.3 SLA-2-YTP-BSP鏈亞克隆到pET-28a（+）

將與pMD 19-T Simple載體鏈接的重組質粒經雙酶切，回收后與 pET-28a（+）連接，轉化至感受態細胞BL21（Rosseta），經雙酶切鑒定發現插入片段大小為870 bp左右，與理論值876 bp相符，見圖4。

圖4 重組質粒pET-28a（+）/SLA-2-YTH-BSP雙酶切鑒定

2.4 序列分析pET-28（+）/SLA-2-YTH-BSP

經序列測定分析，pET-28（+）/SLA-2-YTH-BSP與原序列100%同源，另外，序列末端含有BSP序列部分，見圖5。

2.5 SDS-PAGE分析pET-28（+）/SLA-2-YTH-BSP中的表達

將經鑒定陽性的重組表達菌加入IPTG至1 mmol/L，然后再誘導培養5 h，SDS-PAGE檢測目的基因的表達情況，結果發現重組菌誘導后，與對照相比表達出約30 kD的條帶，與理論值32.4 kD相符，而且相對表達含量達到40%以上，見圖6。

2.5 SLA-2-YTH-BSP蛋白純化

SLA-2-YTH-BSP超聲裂解后，檢測主要以包涵體形式存在，包涵體經過 Ni-NTA柱純化，SDSPAGE檢測，結果（圖7）顯示純化后的蛋白大小約為30 kD，與全菌表達蛋白大小一致。另外，蛋白的純度達到90%以上，符合進行下一步蛋白結構和功能研究的要求。

3 討論

本項目前期研究中，已經成功克隆了煙臺黑

豬SLA-I類分子功能基因SLA-2，并已經在DDBJ/ EMBL/GenBank注冊，獲得序列號AB672508，為進行本研究奠定了基礎［6］。經分析，所克隆煙臺黑豬SLA-2共1 119 bp，其中75-896位屬于胞外區，編碼274個氨基酸殘基（本研究為了提高SLA-2胞外區結合多肽的延展性，實際表達了275個氨基酸）。SLA-2抗原多肽結合區結合抗原多肽后在細胞表面與CD8+T淋巴細胞的T細胞受體（T cell receptor，TCR）結合，形成MHC I-peptide-TCR復合物。為了增加在體外檢測的信號，需要借助生物素-親和素結合原理構建MHC I四聚體［10］。為此，需要在SLA-2胞外區末端加含有17個氨基酸的生物素化酶BirA底物肽（BirA substrate peptide）［11］，以結合生物素，而一分子親和素能結合4分子的生物素，從而形成SLA I-peptide四聚體。四聚體主要用于檢測

SLA I限制性的抗原多肽或TCR。需要指出的是，本研究中PCR擴增SLA-2-YTH-BSP的序列長度為898 bp，是包含了酶切位點和末端的保護性堿基，而酶切后插入片段的長度為876 bp。盡管PCR產物可以直接酶切，與pET-28a（+）連接，但連接的成功率一般不高。為了增加連接的成功率，采用先把插入片段克隆入克隆載體pMD 19-T simple的方法，經大量擴增后，再將酶切回收后的插入片段連接入pET-28a（+），經酶切后，顯示插入片段存在，證明連接成功。但圖中載體質粒顯示有兩條DNA帶，其中下面的條帶應當為未酶切完全的重組質粒，可能是酶量不足或質粒不純所致，但并不影響主要結果。

圖5 SLA-2-YTH-BSP序列

圖6 SDS-PAGE分析pET-28（+）/SLA-2-YTH-BSP中的表達

圖7 SLA-2-YTH-BSP蛋白純化

本研究中采用pET-28a（+）載體，是由于嘗試了其他表達載體后，發現pET-28a（+）更適合SLA-2-YTH-BSP的表達。前期研究中曾報道了我國另一地方品系豬荷包豬重鏈基因偶合底物肽及表達研究，其中用到了另一表達載體pET-21a（+）［5］，二者具有相同的酶切位點NdeI和XhoI，不同的是pET-21a表達的外源基因不攜帶任何非相關序列，而pET-28a（+）表達的外源基因會在5'端攜帶6個His的標簽，從而便于親和純化。本研究中經過SLA-2-YTH-BSP與pET-28a（+）重組后轉化Escherichia coli.BL21（Rosseta），經誘導表達后表達蛋白大小為32 kD，與之前報道的大小一致［5］。另外，重組表達質粒不僅經過酶切鑒定，也經過了測序，序列分析結果表明插入序列與設計的SLA-2-YTH-BSP完全一致。目的蛋白的相對表達含量達到了40%以上，可以用于今后四聚體構建等需要大量表達蛋白的相關研究。另外，由于pET-28a（+）載體多克隆位點上游帶有His標簽，因此可以利用Ni-NTA進行親和純化。本研究中，重組蛋白SLA-2-YTH-BSP主要以包涵體形式存在，說明表達蛋白主要存在于細胞質內。收集包涵體蛋白，經過Ni-NTA親和純化，蛋白純度達到了90%以上，可以用于今后進一步的蛋白結構和功能的研究。

4 結論

構建了煙臺黑豬SLA-I重鏈基因末端生物素修飾的重組表達載體，并獲得表達蛋白，為進一步構建SLA-I-肽復合物，并展開四聚體研究奠定基礎。

［1］ Lemke CD, Graham JB, Lubaroff DM, et al. Development of an MHC class I L（d）-restricted PSA peptide-loaded tetramer for detection of PSA-specific CD8+ T cells in the mouse［J］. Prostate Cancer Prostatic Dis, 2011, 14（2）：118-121.

［2］ Jiang X, Lu X, Liu R, et al. HLA Tetramer based artificial antigenpresenting cells efficiently stimulate CTLs specific for malignant glioma［J］. Clin Cancer Res, 2007, 13（24）：7329-7334.

［3］ Savage P, Millrain M, Dimakou S, et al. Expansion of CD8+ cytotoxic T cells in vitro and in vivo using MHC class I tetramers［J］. Tumour Biol, 2007, 28（2）：70-76.

［4］ Liu G, Wang Q, Tong T, et al. Construction and functional test of a chicken MHC-I（BF2*15）/peptide tetramer［J］. Vet Immunol Immunopathol, 2008, 122（1-2）：1-7.

［5］ 張香春, 馮磊, 張鑫, 等. 荷包豬SLA重鏈基因偶合底物肽及表達研究［J］. 生物技術, 2012, 22（5）：17-20.

［6］ 許剛璞, 許瑜偉. 煙臺黑豬的調查報告［J］. 中國畜禽種業2011（6）：61-62.

［7］ 白婧, 李云崗, 張強, 等. 六品系豬SLA-2多肽結合區分子結構差異研究［J］. 寧夏大學學報, 2012, 33（3）：274-278.

［8］ 高鳳山, 夏春, 張強, 等. 大腸桿菌表達的重組豬β2微球蛋白二級結構的圓二色譜分析［J］. 微生物學報, 2009, 49（12）：1596-1600.

［9］ 鄭秋實, 段晨曦, 陶鳳云. SMAP-29 抗菌肽的原核表達、純化及活性檢測［J］. 生物技術通報, 2013（3）：144-148.

［10］ Yokouchi H, Chamoto K, Wakita D, et al. Tetramer-blocking assay for defining antigen-specific cytotoxic T lymphocytes using peptide-MHC tetramer［J］. Cancer Sci, 2006, 97（2）：148-154.

［11］ Ouyang D, Wang X, He X, et al. Construction of soluble Mamub*1703, a class I major histocompatibility complex of Chinese rhesus macaques, monomer and tetramer loaded with a simian immunodeficiency virus peptide［J］. Cell Mol Immunol, 2009, 6（2）：117-122.

（責任編輯 李楠）

Biotinylated the Carboxyl Terminal of Heavy Chain of SLA-I from Yantai Black Pig and Its Expression

Liu Fa Yang Jingang Zhai Xiaoxin Dong Songpeng Gao Fengshan
（College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622）

To construct the heavy chain of SLA-2 conjugated with the BirA substrate peptide（BSP）and express the recombinant genes in pET-28a（+）for Yantai Black Pig（YTH）, a pair of primers to express the recombinant SLA-2-YTH-BSP was designed and the recombinant SLA-2-YTH-BSP was amplified by PCR followed by sub-cloning the gene into pMD19-T Simple Vector. After identification by cleavage with Nde I and Xho I, the SLA-2-YTH-BSP was ligated to pET-28a（+）and the recombinant plasmids was transformed into BL21（Rosseta）to be induced to express followed by analysis of the expressing products by SDS-PAGE. The expressed interest of protein was purified by Ni-NTA column and detected by SDS-PAGE. The PCR results showed that the length of nucleotides of SLA-2-YTH-BSP was about 900 bp which was consistent with the calculated value. Then, the SLA-2-YTH-BSP with 876 bp was successfully inserted into the pMD-19-T Simple Vector identified by cleavage with Nde I and Xho I, and then the genes were inserted into pET-28a（+）and transformed into Escherichia coli BL21（Rosseta）. After induction, SLA-2-YTH-BSP was successfully expressed with the interest of protein about 32.4 kD. After purification, the purity of the interest of the inclusion protein reached to 90%. It was concluded that the recombinant expressing system containing SLA-2 conjugated with BSP in pET-28a（+）was successfully constructed and the research would pave the base to construct tetramer in SLA class I.

Yantai black pig SLA-2 Heavy chain gene BirA substrate peptide Purification

2013-09-11

國家自然科學基金項目（31172304），遼寧省大學生創新項目（201311258009），大連大學本科生創新項目（2012029）

劉筏，女，研究方向：動物分子免疫學；E-mail：729652171@qq.com

高鳳山，男，副教授，博士，研究方向：基因工程和動物分子免疫學；E-mail：gfsh0626@126.com