厚頜魴兩個野生群體遺傳多樣性分析

王瑾瑾童金茍張耀光彭作剛

(1. 西南大學生命科學學院, 淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室, 重慶 400715; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

厚頜魴兩個野生群體遺傳多樣性分析

王瑾瑾1童金茍2張耀光1彭作剛1

(1. 西南大學生命科學學院, 淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室, 重慶 400715; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

厚頜魴(Megalobrama pellegrini)俗稱烏鳊, 隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae) 鲌、 亞科(Cultrinae)、魴屬(Megalobrama)[1], 是長江上游特有的經濟魚類之一。厚頜魴曾被認為是三角魴(M. terminali)的同種異名, 后經羅云林[2]對魴屬物種的性狀差異進行詳細分析后, 將其確立為有效種。然而, 近年來, 由于棲息地不斷被破壞、片段化以及過度捕撈等人為因素的影響, 厚頜魴的種群數量處于急劇下降趨勢[3,4]。同時, 三峽大壩及長江上游梯級電站的陸續開發嚴重改變了長江上游的水文環境,如原來的流水環境變成靜水環境, 這對厚頜魴這種在繁殖季節對流水條件要求較為苛刻的物種來說無疑是一種毀滅性的破壞[5]。據調查, 目前厚頜魴在長江上游的干流及其大型支流基本絕跡, 僅于長江上游的一級支流——龍溪河尚存在種群規模的野生厚頜魴群體[3], 而且研究表明, 此水域的厚頜魴種群資源由于過度開發其資源量仍處于下降趨勢[4]。劉軍[6]曾根據瀕危系數、遺傳損失系數和物種價值系數將魚類的優先保護順序劃分為四個級別, 厚頜魴已達到三級急需保護物種。

生物的遺傳多樣性水平是長期進化的產物, 是評估生物資源現狀的一個重要參數, 遺傳多樣性越高, 即遺傳變異越豐富, 則對環境的適應能力就越強, 其生存的競爭力就越強。然而, 目前關于厚頜魴遺傳多樣性的研究較少。劉煥章和汪亞平[8]基于同功酶標記對厚頜魴合江群體的遺傳多樣性進行了初步評估; Wang等[9]基于微衛星標記對厚頜魴龍溪河群體的遺傳多樣性進行了初步評估,得到的結果均顯示厚頜魴群體的遺傳多樣性水平較低。本研究同時采用核基因標記——微衛星標記(Simple sequence repeat, SSR)和線粒體標記(Mitochondrial DNA, mtDNA)——細胞色素b基因(Cytb)與控制區(D-loop)序列,分別對龍溪河水域及球溪河水域的厚頜魴野生群體的遺傳多樣性進行比較分析, 試圖從分子水平比較這兩個厚頜魴野生群體的遺傳多樣性差異, 以期為厚頜魴的種群復壯和種質資源的合理開發與利用等保護管理研究提供有價值的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中的 2個厚頜魴野生群體分別來源于長江上游的一級支流——龍溪河, 以及沱江的一級支流——球溪河。其中, 厚頜魴龍溪河群體(LXH)于2010年不同時段采自四川省瀘州市龍溪河(同 Wang等[9]中的野生群體),實驗樣本量(Number of individuals, N)共計30尾; 厚頜魴球溪河群體(QXH)于2011年10月購自四川省瀘州市龍陽區漁種站(該群體來源于近幾年球溪河水域的野生厚頜魴作為親本經人工繁殖得到的子一代群體, 且親本數在 10對以上, 故本研究將其視為“野生群體”), 實驗樣本量(N)共計 32尾。上述兩個群體的代表樣本均是隨機取樣, 且每尾標本分別取其新鮮肌肉與鰭條于 95%酒精中固定,–20℃保存備用。

1.2 基因組DNA的提取

樣品基因組 DNA的提取采用 DNeasy Blood and Tissue kit(QIAGEN)試劑盒, 具體步驟參照試劑盒手冊。

1.3 引物設計及PCR擴增

微衛星標記: 參考 Wang等[9]研究中開發的厚頜魴多態性微衛星標記, 本研究共選取 10個多態性相對較高(如多態信息含量＞0.5)且未偏離哈迪-溫伯格平衡的微衛星標記(MP8、MP14、MP15、MP16、MP17、MP28、MP32、MP40、MP45和 MP48) (登錄號分別是: JQ087472、JQ087475、JQ087476、JQ087477、JQ087478、JQ087483、JQ087486、JQ087488、JQ087492、JQ087494)。具體的引物序列、PCR擴增、產物檢測及其記數等詳見Wang等[9]。

線粒體標記: Cytb基因片段的引物為通用引物L14724(5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′)和H15915(5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′)[10]; D-loop片段的引物為本研究設計的厚頜魴特異性引物MP-CR_F(5′-CGGTCTTGTAATCCGAAGATCG-3′)和MP-CR_R(5′-CATGTGTAAGTCGGGTAAGAGCTG-3′)。PCR反應總體系為 25 μL, 其中, 10×Buffer (TaKaRa) 2.5 μL, MgCl2(30 mnol/μL) 1.5 μL, dNTPs (10 mmol/L) 2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL, rTaq聚合酶9 (TaKaRa) 1U, 模板DNA 100 ng。反應條件: 94℃預變性2min; 隨后30個循環, 每一次循環的參數設置為94℃變性 30s, 56℃退火 30s, 72℃延伸 90s; 最后 72℃終延伸7min。PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 然后直接由華大基因(BGI)完成純化回收及雙向測序工作。

1.4 數據分析

微衛星標記: 應用軟件POPGENE 1.31[11]、CERVUS 3.0.3[12]和 Arlequin 3.5[13]分別完成對厚頜魴遺傳結構的分析, 計算的基本參數主要有: 等位基因數(Number of Allele, Na)、觀測雜合度(Observed Heterozygosity, Ho)、期望雜合度(Expected Heterozygosity, He)、多態信息含量(Polymorphic Information Content, PIC)、哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE)、遺傳分化指數(Fixation Index, Fst)和分子方差分析(Analysis of Molecular Variance, AMOVA)等。

線粒體標記: 測序獲得的Cytb與D-loop序列集分別由Clustal X軟件[14]、Seaview軟件[15]進行編輯、校正和比對。通過 DnaSP 5.0軟件[16]統計各群體的單倍型數(Haplotype, H)、單倍型多樣性指數(Haplotype diversity, Hd)、變異位點數(Variable site, V)、核苷酸多態樣性指數(Nucleotide diversity, Pi)等。使用Arlequin 3.5軟件[13]計算兩兩群體間的Fst值, 并進行AMOVA分析。單倍型間遺傳距離通過1000次重抽樣進行顯著性檢驗。單倍型序列由 Sequin 12.30軟件(NCBI)完成注釋, 并提交至GenBank獲取序列號。

2 結果

表1 厚頜魴龍溪河群體(LXH)和球溪河群體(QXH)在10個微衛星位點上的等位基因數(Na)、期望雜合度(Ho)、觀測雜合度(He)、多態信息含量(PIC)和偏離哈迪-溫伯格平衡(HWE)顯著性檢驗Tab. 1 Number of alleles (Na), observed heterozygosity (Ho), expected heterozygosity (He), polymorphism information content (PIC) and the significant test of deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) of 10 microsatellite loci in the two wild populations of M. pellegrini (LXH & QXH)

2.1 厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體的遺傳多樣性

基于10個微衛星標記計算出的厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體的遺傳多樣性結果如表1所示。龍溪河群體所檢測到的微衛星平均等位基因數為3.8個, 平均觀測雜合度為0.63, 平均期望雜合度為0.62, 平均多態信息含量為0.54, 其遺傳多樣性呈中等水平。而與龍溪河群體相比,球溪河群體的遺傳多樣性與之相當, 如: 平均等位基因數為 3.7個,平均觀測雜合度為 0.64, 平均期望雜合度為0.64, 多態信息含量為0.55。此外, 10個微衛星標記中有5個位點(MP16、MP17、MP28、MP40和MP45)在球溪河群體中顯著或極顯著地偏離了哈迪-溫伯格平衡(P＜0.05)。

基于線粒體標記計算出的兩個厚頜魴野生群體的遺傳多樣性結果如表 2所示。經比對得到的 Cytb片段與D-loop片段的大小分別為1121和937 bp, 均無插入、缺失。Cytb片段在兩個野生群體(共計62個個體)中共檢測到4個變異位點, 2種單倍型(Ha1、Ha2); 其中, 在龍溪河群體的 30個個體中只檢測到一種單倍型(Ha1; GenBank登錄號 KC425463), 因此, 單倍型多樣性指數(Hd)、變異位點數(V)、核苷酸多樣性指數(Pi)均為 0, 顯示其遺傳多樣性水平極低; 而在球溪河群體中除了擁有 Ha1單倍型(GenBank登錄號KC425464)外, 還檢測到第2種單倍型(Ha2; GenBank登錄號KC425465), 表現出的多樣性比龍溪河群體略高(Hd=0.272, V=4, Pi=0.00097)。與Cytb片段相比, D-loop片段表現出更高的序列變異, 在兩個群體(共計62個個體)中共檢測到19個變異位點, 組成6種單倍型; 其中, 在龍溪河群體中共檢測到2種單倍型(Ha1、Ha2; GenBank登錄號分別為KC425466和KC425467), 在球溪河群體中共檢測到5種單倍型(Ha1、Ha3、Ha4、Ha5、Ha6; GenBank登錄號 KC425468—KC425472)。與 Cytb的結果相似, D-loop片段的計算結果同樣顯示厚頜魴球溪河群體的遺傳多樣性水平比龍溪河群體的遺傳多樣性高(龍溪河群體: H=2, Hd=0.239, V=3, Pi=0.00077; 球溪河群體: H=5, Hd=0.423, V=15, Pi=0.00243)。

2.2 厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體的間遺傳分化

分別基于微衛星標記與線粒體 DNA標記(Cytb 和D-loop)對厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體間的遺傳分化進行分子方差分析(AMOVA)、遺傳分化指數(Fst)計算, 并進行顯著性檢驗(表 3)。結果表明, 遺傳變異主要發生在群體內(87.62%—91.66%)而非群體間, 且龍溪河群體與球溪河群體間存在顯著的遺傳分化(Fst=0.083—0.124, P＜0.05)。

3 討論

表2 基于線粒體標記(Cytb和D-loop)檢測厚頜魴龍溪河群體(LXH)和球溪河群體(QXH)的遺傳多樣性信息Tab. 2 Genetic variations in two wild populations of M. pellegrin (LXH & QXH) based on mitochondrial DNAs (Cytb & D-loop)

表3 厚頜魴龍溪河群體(LXH)和球溪河群體(QXH)間遺傳分化分析及分子方差分析Tab. 3 Pairwise Fstestimates and hierarchical portion of genetic diversity by AMOVA for the two wild populations of M. pellegrini (LXH & QXH) based on microsatellite loci and mitochondrial DNAs (Cytb and D-loop)

3.1 遺傳標記的選擇

DNA分子標記是基因的直接反應, 不受環境和其他因素的影響, 無組織特異性, 不受基因表達與否的影響,具有數量豐富、多態性強及操作簡便等特點。其中, 微衛星標記與線粒體DNA由于突變速率快、多態性高等特性已被廣泛應用于種群遺傳結構等方面的研究[17—19]。在本研究中, 10個微衛星標記與D-loop片段在兩個群體中分別表現出多態, 但與之相比, Cytb基因片段在野生群體的30個個體中沒有檢測到變異位點, 在球溪河群體的32個個體中也只檢測到 4個變異位點, 2個單倍型。理論上, D-loop作為一個非編碼區所承受的選擇壓力較蛋白編碼基因 Cytb要小的多(即約束力相對小), 通常情況下, D-loop片段的進化速率普遍要高于Cytb基因的進化速率,如McMillan 和 Palumbi[20]曾指出蝴蝶魚的D-loop片段的進化速率非常快, 是Cytb序列進化速率的33—43倍。因此, 本研究選擇的微衛星標記與D-loop片段較Cytb片段更適合作為檢測厚頜魴群體遺傳變異的有效標記。

3.2 哈迪-溫伯格平衡

本研究采用的10個微衛星標記中有5個位點(MP16、MP17、MP28、MP40和MP45)在球溪河群體中顯著或極其顯著地偏離了哈迪-溫伯格平衡(表1)。在種群遺傳學研究中, 經常會出現偏離哈迪-溫伯格平衡的現象, 主要原因有華倫德效應(Wahlund effect)、近親交配(inbreeding)、無效等位基因(Null alleles)等致使的雜合度不足等[21]。在球溪河群體中, 位點MP16、MP17、MP28及MP40存在純合子過剩現象(Ho＜He), 而在位點 MP45則存在著雜合子過剩現象(Ho＞He)。而球溪河群體源自于人工繁殖的子一代, 有限的親本數量很可能導致近親交配, 這就不難理解為何在球溪河群體中有5個位點都偏離哈迪-溫伯格平衡。

3.3 遺傳多樣性

厚頜魴是我國長江上游地區的特有魚類, 具有重要的生態價值和遺傳價值。本研究首次采用微衛星標記和線粒體 DNA標記(Cytb 和 D-loop)對龍溪河和球溪河水域的厚頜魴野生群體的遺傳多樣性進行了評估。其中, 微衛星標記的分析結果顯示, 與長江上游其他特有物種相比,如圓口銅魚(Coreius guichenoti)[22]、稀有鯽(Gobiocypris rarus)[23]、巖原鯉(Procypris rabaudi)[24], 厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體的遺傳多樣性均處于中等偏低水平。而從線粒體DNA分析的結果來看, 兩個群體的單倍型多樣度(Hd)與核苷酸多樣度(Pi)均較小(Hd＜0.5, Pi＜0.5%), 暗示厚頜魴自然群體近期可能經歷過瓶頸效應(Bottleneck effect)[25]。此外, 線粒體 DNA數據的分析結果顯示球溪河群體較龍溪河群體的遺傳多樣性更高。用于本研究中的厚頜魴球溪河群體來自于球溪河親本人工繁殖的子 1代,雖然球溪河水域尚有厚頜魴的蹤影, 但卻很難再捕撈到種群規模的厚頜魴樣本。由此可見, 即使目前棲息于球溪河水域的野生厚頜魴數量極其有限, 但仍保存著略高于龍溪河水域厚頜魴的遺傳多樣性。因此, 源于球溪河水域的野生厚頜魴較龍溪河水域的野生厚頜魴更適用于人工繁殖, 對其種群資源的復壯具有更顯著的價值。

3.4 遺傳分化

遺傳分化指數Fst是揭示群體間遺傳分化程度的重要參數。本研究基于微衛星標記、Cytb和D-loop片段計算出的厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體間的遺傳分化指數分別為0.083、0.124和0.090, 根據Wright[26]對Fst值的劃分顯示, 本研究中的這兩個野生厚頜魴群體間存在著中等程度的遺傳分化。我們分析存在這一現象的主要原因是地理阻隔, 因為龍溪河河口上游存在一個天然懸崖,形成了龍溪河和長江干流之間的天然阻隔[3], 從而導致龍溪河水域的厚頜魴群體與球溪河(沱江一級支流)水域的厚頜魴野生群體難以進行基因交流。

總之, 根據本研究的結果, 我們認為在野生厚頜魴資源一時難以大量發現和獲取的現狀下, 現有來自于球溪河的野生群體和人工繁殖子一代群體具有重要的保護和利用價值。

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STUDY ON THE GENETIC DIVERSITY OF TWO WILD POPULATIONS OF MEGALOBRAMA PELLEGRINI (TELEOSTEI, CYPRINIDAE)

WANG Jin-Jin1, TONG Jin-Gou2, ZHANG Yao-Guang1and PENG Zuo-Gang1
(1. The Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development (Ministry of Education), Southwest University School of Life Science, Chongqing 400715, China; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

厚頜魴; 微衛星標記; 線粒體標記; 遺傳多樣性; 遺傳結構

Megalobrama pellegrini; Microsatellite; Mitochondrial DNA; Genetic Diversity; Genetic Structure

Q346+.5

A

1000-3207(2014)05-0975-05

10.7541/2014.144

2013-05-23;

2014-02-26

中國長江三峽集團公司科研項目(No. CT-12-08-01); 公益性行業(農業)科研專項經費(200903048-08)資助

王瑾瑾(1987—), 女, 河北石家莊人; 碩士; 研究方向為動物進化與系統學。E-mail: wangjin87@126.com

彭作剛(1976—), 研究員; E-mail: pengzuogang@gmail.com

doi: 10.7541/2014.145