三角帆蚌熱休克蛋白60基因克隆及其表達分析

吳圣楠劉大偉劉 毅胡寶慶張建強王 艷王 婷

(1. 江西師范大學生命科學學院, 南昌 330022; 2. 南昌大學生命科學與食品工程學院, 南昌 330031)

三角帆蚌熱休克蛋白60基因克隆及其表達分析

吳圣楠1劉大偉2劉 毅1胡寶慶2張建強1王 艷1王 婷1

(1. 江西師范大學生命科學學院, 南昌 330022; 2. 南昌大學生命科學與食品工程學院, 南昌 330031)

利用3′RACE技術, 對高通量轉錄組測序所得三角帆蚌HSP60基因(hcHSP60)長片段(2629 bp)進行了3′末端克隆, 經拼接得到hcHSP60 cDNA全長序列。采用多種分子生物學軟件對hcHSP60 cDNA全長序列進行了特征分析, 并采用 RT-PCR技術檢測了其組織分布及經冷熱應激后的表達變化。結果顯示, hcHSP60 cDNA全長為2807 bp, 其中開放閱讀框為1707 bp, 編碼568個氨基酸, 預測分子量大小為61.04 ku, pH 7.0時的理論等電點為5.63。序列中不存在信號肽與跨膜結構。氨基酸序列保守性分析表明, hcHSP60氨基酸序列與光滑雙臍螺HSP60同源性最高(達82%), 而與牙鲆、白云金絲魚HSP60的同源性最低(為75%)。RT-PCR檢測結果表明, hcHSP60在肝胰腺中的表達水平最高, 而在血液中的表達水平最低。30℃與35℃水溫處理三角帆蚌4h后, 各組織中hcHSP60表達水平明顯上升, 表明hcHSP60可能在三角帆蚌耐熱應激反應中起著重要作用。

三角帆蚌; 熱休克蛋白60; 序列分析; 表達

熱休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)是生物體在受到物理或化學刺激時發生應激反應所產生的一類蛋白質, 又名應激蛋白。根據分子量的不同, 可以將HSPs分為HSP90、HSP70、HSP60及小分子量HSP等若干家族[1]。HSPs首次從熱激果蠅幼蟲唾液腺部位分離得到[2]。HSPs分子在正常狀態下能幫助新生肽鏈折疊, 而在應激狀態下, HSPs被大量誘導, 其分子伴侶作用變大, 當細胞受到各種刺激時,蛋白質肽鏈由折疊變成延伸, 空間構型也發生改變,進而與突變蛋白結合, 使后者解離, 并通過多肽折疊、復性以維持細胞自穩定, 從而防止細胞受損[3,4]。

HSP60分子是 HSPs家族中最為保守的分子伴侶蛋白, 大多數成員為組成型表達蛋白[5]。HSP60在真核生物中主要存在于線粒體中, 蛋白N-末端有一個線粒體定位序列, 能夠引導HSP60進入線粒體中[6]。HSP60基因如發生突變, 會導致線粒體功能障礙[7]。HSP60在細胞生命活動中占據著非常重要的地位, 當機體處于應激狀態時, HSP60被大量合成,進入循環系統, 協助變性蛋白恢復其天然結構[8]。迄今除了研究最多的細菌 HSP60, 還在赤點石斑魚(Epinephelus akaara)[9]、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)[10]、草魚(Ctenopharyn odon idellus)[11]、凡納賓對蝦(Litopenaeus vannamei)[12]等物種中克隆出HSP60全長序列, 并對它們的基因結構、功能和組織表達進行了研究, 而針對軟體動物HSP60的研究則尚不多見。

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我國特有的淡水育珠蚌, 用其培育的珍珠質量上佳, 近年淡水育珠蚌培育珍珠開始發展[13]。但日益嚴重的病害給我國淡水育珠產業造成了重大經濟損失。HSPs是生物體內的重要抗感染和抗逆蛋白分子, 對三角帆蚌HSPs的深入研究有助于我國淡水育珠產業的健康發展。本研究利用 3′RACE技術, 對高通量轉錄組測序所得三角帆蚌 HSP60基因(hcHSP60)長片段(2629 bp)進行了3′末端克隆, 經拼接得到hcHSP60 cDNA全長序列, 采用多種分子生物學軟件對其進行特征分析, 并采用 RT-PCR技術檢測了其在多種組織中的表達分布及在冷熱應激后的變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用三角帆蚌購自南昌市人民公園菜市場, 體長約10—15 cm。購回實驗室后, 立即用自來水將蚌殼上的淤泥仔細刷洗干凈, 置于盛有曝氣自來水的水族箱(100 cm×60 cm×45 cm)中暫養, 箱中水量不宜過多, 以剛剛淹沒蚌體為佳。每天用曝氣自來水換水1至2次, 充氣泵充氣飼養, 暫養1周確認蚌體健康無病之后方開始實驗。

1.2 核酸提取與cDNA模板合成

采用 Invitrogen公司的 Trizol試劑盒提取總RNA, 操作過程中(包括組織總 RNA提取以及應用RNA的所有相關實驗)所用離心管及槍頭都經1 g/L焦碳酸二乙酯(Diethylpryocarbonate, DEPC)水處理過夜, 琉璃器皿及金屬器械經180℃高溫烘烤6h以上使RNase徹底失活。RNA的具體提取參考試劑盒的說明書進行。cDNA合成按SMART cDNA Synthesis Kit操作手冊進行。

1.3 hcHSP60 cDNA全長獲得

始自 hcHSP60 cDNA 5′末端的 1條長段序列(2629 bp)由轉錄組高通量測序結果獲得, 轉錄組測序工作由北京貝瑞和康生物技術有限公司完成。依據此序列, 采用Clontech公司的SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得該基因的3′端序列。擴增時共設計2條引物: HSP60-F1與HSP60-F2。首先使用逆轉錄酶 SMARTScribe? Reverse Transcriptase和引物3′ CDS primer A 對總RNA進行逆轉錄合成 cDNA, 再使用引物 HSP60-F1和 UPM (Long引物和Short引物按1︰3比例混勻所得), 以上面合成的cDNA為模板進行第一輪PCR擴增; 將第一輪 PCR擴增產物稀釋 50倍, 然后用引物HSP60- F2和 UPM進行第二輪PCR擴增, 將第二輪PCR產物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化, 純化后的PCR產物與pMD18-T進行連接, 轉化后挑取陽性克隆測序, 最后進行全長序列拼接, 得到hcHSP60 cDNA全長序列。用于hcHSP60基因擴增與表達的引物見表1。

表1 hcHSP60基因擴增與表達所用引物Tab. 1 Primers used in amplification and expression of hcHSP60

1.4 hcHSP60基因序列分析與系統進化樹構建

利用 ExPASy(http://expasy.pku.edu.com)上軟件分析 hcHSP60氨基酸序列與開放閱讀框(ORF);采用NCBI BLASTp進行序列同源基因搜索; 利用SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測分析信號肽, 用 TMHMM 軟件預測跨膜區;利用ClustalW 1.83軟件比較hcHSP60與其他物種HSP60氨基酸序列同源性; 采用 Mega 4.0軟件的鄰接法(N-J法)構建基于氨基酸序列的系統進化樹,并采用自展法(Bootstrap Method)對其可靠性進行分析驗證(1000個假重復數)。用于氨基酸比對和進化樹構建的基因名稱及其 GenBank序列登錄號見表2。

1.5 hcHSP60在不同組織中的表達

從暫養蚌的水族箱中選取3個蚌, 取血液、鰓、肝胰腺、外套膜及肌肉等 5種組織, 用 Trizol法提取總 RNA, 用紫外分光儀(UV-5100)測定濃度并統一稀釋至100 ng/μL, 各取2 μL反轉錄成cDNA, 利用RT-PCR法檢測室溫下(20 ℃)hcHSP60在三角帆蚌不同組織中的表達, 引物見表 1。PCR擴增條件: 94 ℃5min; 94 ℃ 30s, 58 ℃ 30s, 72 ℃ 90s, 40循環; 72 ℃ 10min。產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.6 hcHSP60在冷熱應激后的表達變化

將蚌分成7組(每組放置3個), 分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃及35℃等7種水溫,放置4h后分別取其血液、鰓、肝胰腺、外套膜及肌肉等組織, Trizol法提取各組織的總 RNA, 利用RT-PCR法檢測hcHSP60在不同組織中的表達變化, PCR擴增條件同1.5。

通過Quantity One軟件計算目的條帶和β-actin條帶的光密度比值, 結果使用SPSS20.0軟件中的單因素方差分析法(One-way ANOVA)進行統計分析, P＜0.05為顯著性差異。

表2 用于氨基酸序列比對及進化樹構建的60基因登錄號Tab. 2 Genes of HSP60 used for multiple alignments and construction of phylogenetic tree

2 結果

2.1 hcHSP60 cDNA全長及推導的氨基酸序列特征

以三角帆蚌血液組織總 RNA為模板, 通過 3′RACE-PCR擴增, 獲得長度為178 bp擴增片段, 序列拼接獲得的hcHSP60基因cDNA全長為2807 bp (GenBank登錄號: KF941200), 其中5′端非翻譯區69 bp, 3′端非翻譯區 1031 bp, 有典型的加尾信號(AATAAA)和 PolyA尾巴。該基因開放閱讀框為1707 bp, 編碼 568個氨基酸, 預測分子量大小為61.04 ku, pH 7.0時的理論等電點為5.63。多重比對結果證明 hcHSP60符合 HSP60s所有特征。使用SignalP 4.0預測hcHSP60無信號肽, TMHMM預測hcHSP60無跨膜區。

2.2 序列同源性

利用Clustal X1.8和GeneDoc軟件對13個物種的HSP60氨基酸序列進行了同源比對(表2)。hcHSP60氨基酸序列與光滑雙臍螺(Biomphalaria glabrata) HSP60的同源性最高, 達82%; 與牙鲆(Paralichthys olivaceus)與白云金絲魚(Tanichthys albonubes) HSP60的同源性最低, 為75%。

2.3 HSP60系統進化樹

圖1 HSP60系統進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of HSP60 gene

應用Mega4.0軟件按鄰接法構建了HSP60系統進化樹(圖1)。結果顯示, 所列物種分為4個分支, 其中, hcHSP60與光滑雙臍螺 HSP60在一個分支上,表明在所選的物種中, hcHSP60與光滑雙臍螺HSP60之間的分子進化地位最近。

2.4 hcHSP60組織表達

提取室溫條件下(20 )℃ 的三角帆蚌血液、鰓、肝胰腺、外套膜及肌肉等5種組織總RNA, 經逆轉錄得到cDNA, 利用RT-PCR, 分別擴增得到長度為141 bp的hcHSP60片段和長度為145 bp的β-actin片段(圖2)。從圖4可以看出, hcHSP60在各個組織中均有表達, 以肝胰腺中的表達水平最高, 其次為肌肉、外套膜及鰓, 而在血液中的表達最低。

2.5 冷熱應激后的hcHSP60表達變化

由圖3可以看出, 經30℃或35℃刺激4h后, 各組織中hcHSP60的表達水平明顯高于其他幾種溫度下的表達。其中, 血液 hcHSP60表達峰值出現于35 , ℃ 而其他4種組織中的hcHSP60表達峰值皆出現于30℃。

3 討論

HSP60廣泛存在于原核生物和真核生物中, 是HSPs家族中最為保守的司細胞保護作用之伴侶蛋白分子[5]。不同物種的HSP60基因結構非常保守, 赤點石斑魚HSP60 基因編碼578個氨基酸[7], 三疣梭子蟹的HSP60基因編碼577個氨基酸[10]。本研究所克隆hcHSP60開放閱讀框編碼568個氨基酸, 蛋白分子量為61 ku, 等電點為5.63。氨基酸序列比對顯示hcHSP60和其他物種HSP60氨基酸序列有較高的相似性, 都在70%以上, 與光滑雙臍螺HSP60相似性高達82%。系統進化分析表明hcHSP60與同屬軟體動物的光滑雙臍螺聚為一支,表明本研究所克隆的hcHSP60確為熱休克蛋白60家族成員。

圖2 hcHSP60在三角帆蚌不同組織中的表達Fig. 2 The expression of hcHSP60 in different tissues of H. cumingii

圖3 hcHSP60基因在冷熱應激后的表達Fig. 3 The expression of hcHSP60 under different water temperature

hcHSP60作為 HSP60家族中的一員, 含有HSP60家族信號位點(AAVEEGIVPGGG), 而其序列中不存在信號肽, 說明它不是分泌蛋白。依據hcHSP60含有ATP/ADP結合位點(D G V T V A K),基質結合位點(E G M K F D R G Y I S P Y), 線粒體定位序列(A A V E E G I V P G G G)等事實, 表明其作用位點也存在于細胞線粒體中[14]。hcHSP60氨基酸序列中有 1個典型的 C末端 GGM重復序列(GGMGGGM), 還有多個磷酸化位點和N-型天冬酞胺糖基化位點。有研究表明HSP60能借助上述位點激活免疫相關因子IL-8、IL-12、IL-15、B7、MLP、MZP 和NO等, 通過發動天然免疫反應來抵御細菌的入侵[15,16]。

HSP60廣泛存在與各種生物體內, 而不同生物體HSP60在不同組織中的表達水平各異。赤點石斑魚HSP60在肝、腸、鰓、頭腎、胃、腦、脾中均有表達, 以腦中的表達量最高[9]。三疣梭子蟹 HSP60在肝、心、腹肌、觸角腺、鰓、腸、附肢肌肉中皆有表達, 以觸角腺和腸中的表達量最高[10]。而本研究則發現hcHSP60在三角帆蚌的血液、肝胰腺、鰓、外套膜及肌肉中均有表達, 而以肝胰腺中的表達水平最高。推測肝胰腺在三角帆蚌保護機體細胞及其損傷修復方面起重要作用。

HSPs是一類應激蛋白, 可通過傳遞自身“危險信號”, 觸發免疫細胞的免疫應激反應。多種應激因子, 如重金屬、細菌、熱休克都能誘導HSPs的表達。褶紋冠蚌在熱刺激后, 其HSP70在組織中的表達量明顯提高, 以鰓組織中的表達量增加最多, 血淋巴次之, 而肌肉的表達量增加最少[17]。極端嗜熱菌(Pyrococcus furiosus)能生活在98℃的高溫下, 最主要的HSPs分子為HSP60及HSP20, 表明HSP60在提高細菌耐熱能力方面起著重要作用[18,19]。本研究的結果表明, 在相對較高水溫(30℃與 35 )℃下放置4h后, 三角帆蚌各組織中hcHSP60表達量明顯升高,表明hcHSP60在抗熱應激反應中起著重要作用。有研究表明, 冷應激可引起雞肝臟HSP60表達顯著增加[20]、福壽螺個別組織HSP60急劇上升[21], 而本文用較低水溫(5℃、10℃及 15 )℃處理 4h后, 發現各組織中hcHSP60的表達與20℃或25℃處理組之間相比并無明顯變化, 零度及零度以下水溫應激能否刺激hcHSP60的表達上調, 有待于進一步的研究。

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CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF HEAT SHOCK PROTEIN 60 GENE FROM HYRIOPSIS CUMINGII

WU Sheng-Nan1, LIU Da-Wei2, LIU Yi1, HU Bao-Qing2, ZHANG Jian-Qiang1, WANG Yan1and WANG Ting1
(1. College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China; 2. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

Heat shock protein 60 (HSP60) is an important molecular chaperone protein that mainly exists in the mitochondria of organism. In the present study, the cDNA sequence of Hyriopsis cumingii HSP60 (hcHSP60) was cloned by 3′ rapid amplification of cDNA ends methods (3′-RACE) based on a long chain sequence of hcHSP60 (2629 bp) and was determined by high flux sequencing for transcriptome of H. cumingii blood cells, and its expression in the different tissues was detected by using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results showed that the full-length cDNA of hcHSP60 was 2807 bp that contains an open reading frame of 1707 bp, encoding a protein of 568 amino acid residues with 61.04 ku of predicted molecular weight and 5.63 of the theoretical isoelectric point, which was predicted to have no signal peptide and transmembrane helices. The deduced amino acid sequence of hcHSP60 shares the highest identity (82%) with HSP60 of Biomphalaria glabrata, and the phylogenetic analysis demonstrated that they were clustered in a same clade. The results of RT-PCR indicated that hcHSP60 was constitutively expressed in all 5 examined tissues of H. cumingii with the highest expression in hepatopancreas. The expression of hcHSP60 in all detected tissues was up-regulated obviously by higher water temperature, suggesting that it may play an important role in the stress response against heat.

Hyriopsis cumingii; Heat shock protein 60; Sequence analysis; Expression

Q781

A

1000-3207(2014)05-0897-06

10.7541/2014.134

2013-08-11;

2014-03-05

國家自然科學基金項目(31060359); 江西省自然科學基金(20122BAB204017)資助

吳圣楠(1992—), 女, 江西鷹潭人; 碩士研究生; 主要從事分子免疫學研究。E-mail: wusn2013@163.com

劉毅, E-mail: yiliusan@sina.com