抗菌肽的臨床應用與內源性表達調控研究進展

陳紅偉李英倫劉娟吳俊偉黃慶洲

（1.西南大學動物醫學系，重慶 402460；2.四川農業大學動物醫學院，雅安 625014）

抗菌肽的臨床應用與內源性表達調控研究進展

陳紅偉1李英倫2劉娟1吳俊偉1黃慶洲1

（1.西南大學動物醫學系，重慶 402460；2.四川農業大學動物醫學院，雅安 625014）

抗菌肽是具有抗菌活性的一類短肽，具有分子量低、熱穩定、廣譜的抗菌、抗病毒及抑制腫瘤的生物活性，是動植物防御體系的一個重要組成部分，在機體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用。但實踐表明，作為抗生素替代品的抗菌肽的開發并非易事。針對近年來抗菌肽研究的熱點，對抗菌肽的臨床應用和表達調控進行了簡要綜述。

抗菌肽 Ⅲ期臨床試驗 基因表達調控 開發 策略

2010年，Lancet Infect Dis雜志報道的“超級細菌”，對臨床應用的絕大多數抗生素都具有耐藥性，引起了全世界的恐慌，被譽為“抗生素的替代品”的抗菌肽為人類戰勝耐藥微生物帶來了新的契機［1］。起初，人們稱抗菌肽為“Antibacterial peptides”，意為“抗細菌的肽”，中文譯為“抗菌肽”，隨后研究發現有些“抗菌肽”還可以抗真菌、抗病毒和抗寄生蟲等，故改稱為“Antimicrobial peptides，AMPs”，即“抗微生物的肽”［2］，但在國內“抗菌肽”作為一個通俗名稱，已被廣泛采用。據查證，已經有2 000多種抗菌肽被發現，且以很快的速度增長。這些最新抗菌肽都可以在國際上權威的抗菌肽數據庫（http：//www.bbcm.univ.trieste.it/～tossi/antimic.html和 http：//aps.unmc.edu/AP /main.html）中查詢，抗菌肽多來于自微生物、植物和動物［2，3］。目前，部分抗菌肽已進入Ⅲ期臨床試驗階段。本文對其開發策略、臨床研究與應用和表達調控作一綜述。

1 抗菌肽開發的基本策略

一般而言，抗菌肽可通過以下3種途徑獲得［4］：（1）從生物體內直接提取純化；（2）化學人工合成；（3）采用基因工程技術構建抗菌肽基因工程菌株。然而由于抗菌肽為體內誘導合成，生物體中含量較低，從宿主有機體中分離抗菌肽的成本極高，并且對于大多數抗菌肽而言也不現實［5］；隨著多肽及蛋白質化學結構的進一步闡明和多肽合成技術的產生，人工合成具有生物活性的肽或肽段為抗菌肽的研究

提供了很大方便，但針對一些特殊結構的多肽，如人防御素分子中含有3對二硫鍵，化學合成的多肽時難以保證正確配對，從而影響其生物活性［6］；另外化學合成的方法同樣存在成本較高的問題，10個殘基以上多肽的合成很昂貴，限制了抗菌肽的推廣應用［4］。

由此可見，采用提取或合成的方法進行抗菌肽的工業化生產目前還不現實，與此相比，基因工程技術的快速發展正使得借助細菌或酵母等表達系統大規模制備抗菌肽成為可能［4，5］。但從目前抗菌肽基因工程改良方面來看，還存在一些問題有待解決［7］：第一，抗菌肽在轉基因表達過程中對蛋白酶較為敏感，如何解決易被分解的問題；第二，如何保持基因工程改造后與天然抗菌肽空間結構一致性的問題；第三，如何采取適當工藝提高產品回收率，降低回收成本的問題［7］。

2 抗菌肽的臨床研究與應用

一些陽離子抗菌肽已經通過詳細的臨床試驗調查，并完成了Ⅲ期臨床試驗［8］。2012年，Andres等［9］對抗菌肽的臨床研究情況進行了報道，如表1所示。

表1 陽離子抗菌肽的臨床試驗階段［9］

雖然，抗菌肽的臨床試驗研究已經取得了階段性成功，但要大面積地用于臨床還會遇到很多問題［8］，如免疫排斥反應、生理作用的復雜性、潛在的毒副作用、穩定性以及如何有效地降低成本等。可以通過開展研制各種高效低成本的抗菌肽制備生產系統，包括基因工程方法、人工合成法、天然抗菌肽提取純化等制備方法，以及以天然抗菌肽為母體化合物進行結構改造，得到藥物新化合物等［10］，為抗菌肽最終大規模應用于臨床提供堅實的理論基礎和技術保障。與此同時，可積極開展如何提高機體內源性抗菌肽表達的研究，特別是畜禽內源性抗菌肽的表達，這是當前實現抗菌肽推廣應用于畜牧業中經濟而有效的途徑。

3 抗菌肽內源性表達調控研究進展

如上所述，由于天然抗菌肽的來源非常有限，現階段通過化學合成或由基因工程重組表達抗菌肽還存在成本相對較高、難度大等問題，因此提高內源性抗菌肽表達水平是比較經濟有效的方法［4，11］，尤其是針對畜牧生產中抗菌肽的推廣和應用。主要途徑有：（1）通過遺傳方法選育出具有高抗菌肽表達水平的品種或品系；（2）通過外源途徑調控機體內源性抗菌肽表達，而后者有賴于對抗菌肽表達調控機制的深入研究［11］。一般認為，抗菌肽基因表達調控主要表現在以下幾個方面：（1）轉錄水平上的調控；（2）mRNA加工、成熟水平上的調控；（3）翻譯水平上的調控。

近年來，已有大量的研究報道了病原微生物誘導機體內源抗菌肽的表達［12-16］，如采用沙門氏菌攻毒，豬抗菌肽PR-39和protegrin基因轉錄水平提高［17］，但志賀氏細菌對家兔抗菌肽CAP-18的表達起下調作用［18］，也有學者提出如果動物感染疾病嚴

重到一定程度時，其抗菌肽基因表達水平可能下降，病情加劇［19］。另外，在通過外源途徑（非病原微生物）調控機體內源性抗菌肽表達，從而提高機體的防御能力方面，已有部分學者開展了微量養分或中藥對抗菌肽表達調控的研究。

3.1 微量養分對抗菌肽表達的影響

目前，國內外學者已在積極開展諸如維生素、微量元素等微量養分對動物內源性抗菌肽表達的影響研究。2005年，汪以真等［20］報道仔豬日糧中添加不同形式的鋅源ZnSO4、ZnO、納米ZnO均能提高PR-39mRNA表達量，其中以高劑量ZnO（3 000 mg/kg）的調控效果最為顯著，提高量為378.26%。王燕等［21］采用RT-PCR法研究日糧和骨髓細胞中添加不同濃度牛乳鐵蛋白（bLF）對仔豬髓源性抗菌肽PMAP-37基因表達的影響，結果發現，與對照組相比，日糧中添加0.125%和0.25%bLF組分別使PMAP-37基因的表達提高了109.62%和69.23%，骨髓細胞中分別添加10、100和1 000 g/mL bLF在3和6 h誘導后均能提高PMAP-37基因表達趨勢。趙玉蓉等［22］報道了斷奶仔豬日糧中添加1.0%谷氨酰胺（Gln）能顯著增加仔豬血清中IL-1β的含量，顯著上調骨髓和空腸黏膜抗菌肽PR-39 mRNA的相對表達量，分別提高了50.5%和24.0%。Pigeon等［16］采用高鐵飼料喂養或胃腸外途徑給鐵，造成小鼠鐵負荷增多，小鼠肝細胞抗菌肽HepcidinmRNA表達水平顯著增加，并與鐵累積劑量呈正相關，而機體內缺鐵可使Hepcidin的表達顯著降低。2007年，Schwab等［23］報道了丁酸鹽能誘導人腸道抗菌肽LL-37的表達，并表明丁酸鹽介導的LL-37表達上調是受多條信號通路和VDR、TGF-β1等受體的影響。與此同時，Raqib等［24］研究證實，感染志賀氏細菌后，家兔結腸發生潰爛時其腸道上皮細胞不能表達CAP-18抗菌肽，但用丁酸鹽處理后家兔腸道上皮細胞CAP-18表達量增加，嚴重程度減緩以及糞便細菌數量也減少。2012年，Campbell等［25］報道了維生素A、D，膳食組蛋白，丁酸和次膽汁酸對人抗菌肽Cathelicidins等基因表達具有調控作用。黎德兵等［26］研究發現，短期內在飼料中添加2 000 IU/kg的維生素D3可顯著提高黃鱔內臟組織中hepcidin基因的表達量；飼喂周期較長，飼料中添加500 IU/kg維生素D3可顯著提高hepcidin基因在黃鱔肝胰臟和頭腎中的表量。

3.2 中藥對抗菌肽表達的影響

近年來，部分學者在中藥對抗菌肽表達的影響方面進行了大膽的嘗試，為提高機體內源性抗菌肽的表達水平，同時也為中藥作用機理提出新的合理的解釋開辟了新的研究思路。2008年，趙玉蓉等［27］報道了牛膝多糖能顯著促進斷奶仔豬骨髓抗菌PG-1mRNA表達，且日糧中以0.10%添加量為適宜。趙燕飛等［28］采用白術微粉對仔豬抗菌肽PR-39mRNA和Protegrin-1mRNA表達的影響進行研究，結果發現，與對照組相比，0.5%和1%微米白術組分別顯著提高了PR-39mRNA表達量27.86%和58.81%；1%微米白術組顯著提高了Protegrin-1mRNA 表達量75.76%，并提出白術對這兩種抗菌肽的表達有調控作用，可能是通過激活巨噬細胞、內皮細胞和平滑肌細胞等來釋放內源性免疫調控物質，如TNFα、interleukins、INF等，進一步激活PR-39和Protegrin-1的調控因子，進而調控基因表達。2013年，Guo等［29］研究發現姜黃素可以通過維生素D受體依賴性途徑誘導抗菌肽cathelicidin基因表達。

4 展望

隨著抗生素的廣泛應用甚至濫用，抗生素在畜禽產品中的殘留、細菌耐藥性、過敏反應和環境污染等問題日漸嚴重，從而引發了人們對飼料、食品和環境安全的極大關注，迫使人們開始尋找新型抗菌劑［30］。由于抗菌肽具有分子量小、水溶性好、耐熱、對高等動物的正常細胞幾乎無毒害作用等特點，極有可能成為一種高效、低毒并且無殘留的抗菌、抗病毒和抗癌新藥，近年來，國內外對抗菌肽類物質的研究越來越多，已經成為研究的熱點。

如前所述，雖然有不少抗菌肽已經進入Ⅲ期臨床試驗，但主要集中在人醫臨床領域，目前抗菌肽要在畜牧生產中推廣應用，還存在一些瓶頸問題需要解決，首先，天然抗菌蛋白的來源非常有限，分離純化難度大、耗費大、收率低，難以實現工業化生產；其次，現階段通過化學合成或由基因工程重組表達抗菌肽對于需要大面積、大劑量使用的經濟

動物而言，還存在成本相對較高、難度大等問題。因此提高動物機體內源性抗菌肽表達水平是比較經濟有效的方法［10］，如可以通過添加外源性物質（微量養分、中藥等）來提高動物機體內源性抗菌肽水平，進而提高機體的防御能力，為最終實現畜牧業的“健康養殖”提供新途徑。

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（責任編輯 狄艷紅）

Progress on Antimicrobial Peptides’Gene Endogenous Expression Regulation and Clinical Application

Chen Hongwei1Li Yinglun2Liu Juan1Wu Junwei1Huang Qingzhou1
（1. Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Chongqing 402460；2. College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014）

Antimicrobial peptides are a group of small molecular proteins with antibacterial activities, which are key components of animal and vegetation defense system and play an important role in protecting body from invasion of pathogens. These peptides have many characters such as low molecular weight, thermostability. And they have the wide range of antibacterial, antiviral spectrum and inhibiting growth of tumor cells. However, the development of antimicmbial peptides as antibiotic substitutes is far from easy. The recent warm spots about antimicrobial peptides, especially gene expression regulation and clinical application were reviewed.

Antimicrobial peptides Ⅲ clinical trials Gene expression regulation Development Strategy

2013-09-16

中央高校基本科研業務費專項（XDJK2012C099），重慶市科委自然科學基金計劃資助項目（cstc2012jjA80013）

陳紅偉，男，博士研究生，講師，研究方向：獸醫藥理學與毒理學；E-mail：chw80926@126.com