致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究進展

陸盼盼 郭松林 關瑞章 馮建軍

（集美大學水產學院，廈門 361021）

致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究進展

陸盼盼 郭松林 關瑞章 馮建軍

（集美大學水產學院，廈門 361021）

弧菌為水產養殖環境中常見的條件致病菌，其暴發可導致養殖魚蝦貝類大量死亡。由于常用的化學藥物防治方法存在耐藥性、藥物殘留等問題使得弧菌病的防治面臨新的挑戰，因而如何獲得安全有效的防治方法成為弧菌所致疾病研究的重點和難點。弧菌為革蘭氏陰性菌，外膜是該類型菌細胞壁特有的結構，由蛋白、糖和脂質構成。其中外膜蛋白易為宿主免疫系統識別為異物，可以激發機體的體液免疫和細胞免疫，有可能作為弧菌疫苗的有效成分。對弧菌外膜蛋白免疫原性的研究進展作一綜述，以期為弧菌病的防治在外膜蛋白水平上提供一種有效的解決途徑。

弧菌 外膜蛋白 免疫原性 免疫保護作用 交叉免疫保護作用

1 致病性弧菌及其所致疾病

近年來，隨著魚類養殖規模的不斷擴大，魚類病害頻繁發生，對魚類規模化養殖和發展造成了巨大的威脅，海水養殖魚類尤以弧菌病較為嚴重，已成為人們研究關注的焦點。弧菌為一類革蘭氏陰性、兼性需氧的桿菌和彎曲桿菌，是水產養殖環境中常見的條件致病菌，弧菌病的暴發可導致養殖魚蝦貝類大量死亡［1］。弧菌屬共包括46個種類，其中12種與人類感染相關，超過27種與魚類和貝類感染有關［2］。國內外學者調查發現弧菌病的發生既沒有宿主種屬選擇性和地理差異性，亦無季節性和時間的區分，夏秋兩季較多發，流行適宜溫度為25-32℃。引發弧菌病的病原性弧菌最早從歐洲鰻鱺中分離獲得，迄今為止報道的水產養殖動物致病性弧菌有數十種之多（表1）。感染弧菌病的水產動物主要有皮膚潰瘍、爛尾、爛鰭及出血等癥狀，從而引發動物對外界反應遲鈍以及攝食率下降等。國內外已經報道的弧菌病病原主要有副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）、鰻弧菌（V. anguillarum）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、哈維氏弧菌（V. harveyi）、

創傷弧菌（V. vulnificus）、擬態弧菌（V. mimi cus）、產氣弧菌（V. gazogenes）和河弧菌（V. f luvialis）等［3］。弧菌病常采用化學藥物消毒預防和抗生素治療，但近年來長期濫用抗菌素不僅造成嚴重的環境污染和藥物殘留問題，而且使得致病性弧菌對藥物的耐藥性不斷增強，產生了許多新的耐藥菌株，傳統藥物的治療效果越來越差，使得弧菌病的防治面臨著新的挑戰［1］。因此，如何獲得安全有效的防治方法成為該研究領域的重點和難點。

表 1 水產動物主要致病性弧菌及其宿主

2 外膜蛋白的基本特征和弧菌主要外膜蛋白

革蘭氏陰性細菌的外膜是細胞壁的主要結構，在細菌與宿主的相互關系中發揮著重要作用，外膜具有典型的非對稱性磷脂雙層結構，位于菌體胞漿膜和肽聚糖的外側，將整個細菌包圍，膜厚度約8-10 nm，由蛋白、糖和脂質構成［4］。外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMPs）位于細胞壁表層，是革蘭氏陰性菌特有的外膜主要結構成分，在維持細菌細胞結構穩定、細胞的物質交換及細菌的致病過程中起著十分重要的作用，并且易為宿主免疫系統識別為異物，不僅可以激發機體的體液免疫應答，而且還可引起細胞免疫且副作用較小，有可能作為疫苗的有效成分［5-8］。Chart等［9］從鰻弧菌中分離出的2個小分子量的外膜蛋白，能夠有效地刺激機體的免疫反應。

OMPs是重要的黏附因子，宿主的免疫防御系統能很容易識別這些外來物質［10］。OMPs具有高度疏水結構可維持結合反應，在宿主感染和致病性中起重要作用，同時OMPs可粘附于黏膜上，與肝臟相關的淋巴組織抗原遞呈細胞可很容易地將其作為抗原遞呈給免疫細胞［11］。通過NCBI對弧菌外膜蛋白基因搜索可發現弧菌的外膜蛋白主要有OmpK、 OmpU、OmpW及TolC，比對分析表明這些外膜蛋白在不同弧菌間的保守性均較高。

氨基酸序列比對結果表明，外膜蛋白OmpU、OmpW和OmpK在副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌及創傷弧菌中有高度相似性，表明這些蛋白有相似的生物功能［12］。OmpU是重要的膜孔蛋白之一，也是疫苗開發的重要保護性抗原，由OmpU基因編碼，分子量為38 kD，是一種孔通道蛋白，可作為親水性和低分子量物質輸入輸出的通道；OmpU占外膜蛋白總量的30%左右，研究證明，外膜蛋白OmpU 是霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的重要保護性抗原之一［13-16］。富含β-轉角結構的外膜蛋白W（OmpW），成熟蛋白分子量為21 kD，該蛋白的表達依賴體外環境，可能與壓力條件下的適應機制有關［17，18］。外膜蛋白K（OmpK）為弧菌屬的廣泛受體，屬于TSX孔蛋白家族，富含β折疊結構，形成狹長的疏水離子通道，該蛋白與調節細胞滲透壓功能有關［2］。

3 弧菌外膜蛋白免疫原性研究

外膜蛋白位于病原菌表面，多數外膜蛋白具有良好的免疫原性，容易被宿主免疫防御系統識別為異物，從而通過一系列連鎖反應引發機體的體液免疫與細胞免疫。目前已有大量關于弧菌外膜蛋白免疫原性研究的報道，獲得外膜蛋白主要有分離純化和重組表達兩種方法。

3.1 弧菌外膜蛋白的分離純化及其免疫原性

目前用于分離獲得外膜蛋白的方法主要有十二烷基磺酸鈉SDS、SarkosyⅠ和苯甲基磺酰氟PMSF法。其中PMSF分離獲得的蛋白條帶多且密集，難以區分主要外膜蛋白；SarkosyⅠ操作方法簡便且能達到與SDS法相似的效果［19］。研究表明，無論是粗提的外膜蛋白混合物OMPs還是進一步分離獲得的單一外膜蛋白成分均具有良好的免疫原性［20］，并且某些弧菌外膜蛋白能對相應弧菌病原菌的感染提供65%-100%的免疫保護率（表2）。這些研究為開發以弧菌外膜蛋白作為主要抗原的弧菌疫苗奠定了良好的基礎，但分離純化法一次獲得的外膜蛋白量少并且操作過程復雜，因而廣泛應用于生產實踐還有一定的困難。

表2 分離純化的弧菌OMPs免疫原性分析

3.2 弧菌外膜蛋白的重組表達及其免疫原性

隨著基因組學、蛋白質組學以及生物信息學等學科的迅速發展，越來越多的弧菌OMPs基因序列測序工作得以完成。根據NCBI數據庫獲得所需外膜蛋白基因序列設計特異性引物擴增出目標基因，構建合適的載體進行重組表達，從而在一定程度上提高了外膜蛋白疫苗抗原篩選的進度。這類基因工程疫苗生產成本低，易于規模化生產。目前，已有來源于副溶血弧菌［26，27］、哈維氏弧菌［28，29］、溶藻弧菌［30］等弧菌的OMPs得以成功重組表達與純化，并且分別在魚體中進行了免疫接種試驗。結果顯示，這些重組OMPs保持了天然OMPs的免疫原性和免疫保護作用，能有效刺激魚體產生特異性抗體，并且能對相應病原菌的感染提供67.6%-90%不等的免疫保護率（表3）。

3.3 弧菌OMPs多聯疫苗的免疫原性

細菌脂多糖、外膜蛋白偶聯疫苗是20世紀80年代發展起來的新型疫苗。李華等［22］制備了哈氏弧菌外膜蛋白與溶藻弧菌脂多糖偶聯疫苗，結果表明免疫卵形鯧（Trachinotus ovatus）后，脂多糖偶聯外膜蛋白免疫原性顯著增強，對哈氏弧菌的免疫保護率為95%，高于單獨0MPC免疫組的75%保護率。基因工程技術的迅速發展使得漁用疫苗的開發周期和成本大幅度縮短和降低，并且利用生物技術構建的重組OMP疫苗也頗具應用前景。值得一提的是，鄭磊等［31］利用副溶血弧菌外膜蛋白K（OmpK）和鞭毛蛋白A基因（flaA）構建融合表達載體，重組表達的融合蛋白（r-FlaA-OmpK）免疫美洲黑石斑魚，與單一的重組蛋白（r-OmpK）相比，能夠刺激機體產生更高水平的抗體效價和免疫保護作用。副溶血弧菌tdh2基因和鰻弧菌OmpU基因二聯疫苗免疫大菱鲆可對副溶血弧菌和鰻弧菌感染分別提供100%和35%的免疫保護率［32］。

3.4 弧菌外膜蛋白共同抗原的免疫原性

弧菌病的暴發給水產養殖業造成了嚴重損失。水生動物尤其是魚類弧菌病的發生常常是多種（血清型或亞種）弧菌的混合感染，因此篩選具有潛在的交叉保護性蛋白抗原，作為制備多價疫苗或聯合疫苗的侯選成分具有重要意義。研究發現，革蘭氏陰性菌的外膜蛋白中存在保守成分，同種細菌不同菌株的外膜蛋白圖譜很相似，僅有很小的差異，這些差異與菌株的血清型、致病性及生長條件有關［33］。張崇文等［34］利用雙向電泳和免疫印跡相結合的方法，借助于質譜分析技術發現，溶藻弧菌的 一種功能未知的孔蛋白（Porin，GenBank Accession No. ZP_01260407）和副溶血弧菌的一種麥芽糖孔蛋白的前體蛋白（Maltoporin precursor，GenBank Accession No. NP_801154）能夠和哈維氏弧菌全菌多抗產生免疫反應，表明這兩種蛋白可以作為此3種弧菌的交叉保護性抗原。根據SDS-PAGE圖譜及免疫印跡發現，來源于8株弧菌的36 kD外膜蛋白均能與兔抗SR1菌株的血清發生免疫反應，證明36 kD 的外膜

蛋白可能是弧菌共有的特異性抗原［4］。田丁等［35］研究發現38 kD為溶藻弧菌與創傷弧菌共有的外膜蛋白，為探討研制兩者的外膜蛋白亞單位聯合疫苗、達到一種疫苗有效防治2種疾病的目的提供了可能性［35］。另外，研究發現28 kD的OMP是鰻弧菌（V.anguillarum）和副溶血弧菌的共同抗原［36］，但該外膜蛋白對這兩種弧菌的免疫防治效果尚未見研究報道。

表 3 弧菌重組OMPs免疫原性分析

3.5 弧菌OMPs口服疫苗的嘗試

相比于注射免疫及浸泡免疫，口服免疫具有高效性，操作方便，避免對魚體造成損傷，并能同時引起黏膜免疫應答及系統免疫應答等諸多優點［37］。自1942年Duff［38］首次將殺鮭氣單胞菌滅活口服疫苗應用于硬頭鱒獲得成功后，國內外不少學者對魚類腸道黏膜免疫機制的研究不斷深入，魚類口服疫苗的研究取得了一定的進展。

任燕等［39］采用可生物降解的合成高分子聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物（DL-polylactide-co-polyethylene glycol，PELA），包裹哈維氏弧菌重組外膜蛋白OmpK后，制備成PELA-OmpK微球口服免疫鯽魚（Carassius auratus gibelio）。結果表明，加強免疫4周和8周后微球疫苗免疫組可對活菌攻擊提供70%的免疫保護率，顯著高于口服OmpK蛋白組和空白對照組。

4 展望

分離純化和重組表達獲得的弧菌外膜蛋白均具有良好的免疫原性，相對于分離純化法，重組表達操作過程簡單，單次獲得量多。不同種弧菌間的共同外膜蛋白的篩選可有望解決針對單一致病性弧菌研制疫苗時存在的周期長、免疫次數多的弊端，因而極有可能成為有效的弧菌亞單位疫苗抗原成分。隨著生物技術在魚用疫苗開發中的應用，弧菌OMPs多聯疫苗的構建使得外膜蛋白的免疫保護性顯著增強并可實現單次免疫同時抵抗多種弧菌感染的效果。然而，國內外將不同屬病原菌外膜蛋白構建融合表達載體制備二聯疫苗的研究十分少見。本實驗室課題組成員已成功制備遲緩愛德華氏菌OmpS2與嗜水氣單胞菌Ⅱ型孔蛋白二聯疫苗，免疫美洲鰻鱺后可提供較高的免疫保護性［40］。在此基礎上進行弧菌屬與其他種屬細菌二聯外膜蛋白的研究，以期能達到單次免疫防治多種細菌感染的目標。另外值得一提的是，以弧菌OMPs進行免疫保護研究時，常用的注射方法雖然用量小、效果好但易造成傷口感染且工作量大，免疫途徑有待優化，可嘗試口服免疫。

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（責任編輯 狄艷紅）

Review on the Immunogenicity of Pathogenic Vibrio Outer Membrane Proteins

Lu Panpan Guo Songlin Guan Ruizhang Feng Jianjun
（Fishery College，Jimei University，Xiamen 361021）

Vibrio is a common opportunistic pathogen in aquaculture environment, which can lead to an outbreak of mass mortality of fish and shellfish farming. Traditional chemical control methods because of drug resistance, drug residues and other issues make Vibriosis prevention face new challenges, and thus how to get safe and effective prevention and treatment of diseases caused by Vibrio becomes important and difficult. Vibrio is Gram-negative bacteria, the outer membrane is unique to the cell wall of this type of bacteria, which consist of protein, sugar and lipid. The outer membrane protein is easy to be recongnized as foreign by the host immune system then stimulate the humoral and cellular immunity, which may be used as an active ingredient of Vibrio vaccines. A review on the immunogenicity of pathogenic Vibrio outer membrane protein is to provide a new solution for the prevention and treatment of Vibriosis.

Vibrio Outer membrane proteins Immunogenicity Immuno-protection Cross immuno-protection

2013-08-16

國家自然科學基金項目（31001136）

陸盼盼，女，碩士研究生，研究方向：水產動植物病害防治；E-mail：993814556@qq.com

郭松林，男，副教授，碩士生導師，研究方向：水產病原微生物學與免疫學；E-mail：gsl@jmu.edu.cn