人工miRNA沉默基因的研究

張獻賀 孔穩穩 李勇 李晶

（東北農業大學生命利學學院 農業生物功能基因重點實驗室，哈爾濱 150030）

人工miRNA沉默基因的研究

張獻賀 孔穩穩 李勇 李晶

（東北農業大學生命利學學院 農業生物功能基因重點實驗室，哈爾濱 150030）

人工miRNA（amiRNA）是一種高效的基因沉默技術，其原理是以植物內源miRNA的前體為基本骨架，將其莖環結構中的miRNA/miRNA*序列替換為amiRNA/amiRNA*序列，使產生的amiRNA作用于目標靶基因，以實現對靶基因表達的抑制。以擬南芥中轉錄因子基因MYB28為例，介紹了amiRNA的設計基本原理和構建方法。在MYB28基因序列的3'端、5'端和中間部分分別設計了amiRNA，以擬南芥內源的miRNA 319a前體為骨架，以靶向于MYB28的amiRNA序列替代原有的miRNA 319a序列，在擬南芥中過量表達，獲得的轉基因植株中MYB28表達水平平均降低了86%。根據試驗結果對人工miRNA沉默基因技術的特點及應用前景進行了討論。

人工miRNA RNA干擾 擬南芥 基因沉默

RNA介導的基因沉默是真核生物調控基因表達和防御外源核酸入侵的重要機制。細胞中的雙鏈RNA（dsRNA）或具有較長發夾結構的RNA被雙鏈RNA特異性的RNA酶Dicer 剪切成21-24 nt的小干擾RNA片段（Small interfering RNA，siRNA），這些小RNA結合到以AGO蛋白為核心的RNA沉默復合體（RNA inducing silence complex，RISC）上，通過堿基的互補來實現對靶基因mRNA的剪切、抑制蛋白質的翻譯或產生DNA水平的修飾［1］。基于這一基本原理，多種植物基因沉默技術相繼建立起來，包括基于“共抑制”原理的基因沉默技術、反義RNA技術、發夾RNA干擾（hpRNAi）技術及病毒介導的基因沉默（VIGS）技術等［2］，這幾種基因沉默技術的共同點是通過引入的外源序列使細胞內產生雙鏈RNA，從而引發RNA介導的基因沉默（圖1）。盡管這些方法都能實現對目的基因表達的抑制，但它們存在一個很大的弊端，即容易引起“脫靶效應”，因為上述方法形成的雙鏈RNA經過加工后會產生連續的多個小RNA，這些小RNA有很大幾率會作用于和靶序列具有同源性的非目標序列，造成非預期的“脫靶”現象［3］。

miRNA是一類長度為18-25 nt的內源性非編碼

單鏈小RNA，與siRNA相比，其最本質的特點是來源于一段具有莖環結構的前體RNA，經過DCL1等一系列酶的剪切與加工［4-6］最終形成一個成熟的miRNA，與沉默復合體RISC結合，通過堿基互補配對來實現對靶基因mRNA的剪切或抑制其翻譯［7-10］。

圖1 RNAi及amiRNA的基本原理

隨著miRNA調控基因表達的研究日益深入，利用人工miRNA（Artificial miRNA，amiRNA）沉默基因的技術逐步地建立起來［11-14］，其原理是以植物內源miRNA具有莖環結構的前體為基本骨架，將其莖環結構中的miRNA序列替換為可與目標靶基因mRNA部分互補的amiRNA序列，使產生的amiRNA作用于靶基因，以實現對靶基因表達的抑制。由于克服了以往的RNA干擾技術易脫靶的弱點，amiRNA不僅可以高效地沉默基因，同時具有很高的特異性。

為了驗證amiRNA基因沉默技術的有效性并對amiRNA的設計進行優化，本研究以擬南芥中編碼轉錄因子的MYB28基因為目的基因，在基因編碼序列的3'端、5'端和中間部分分別設計了amiRNA，以擬南芥內源的miRNA 319a前體為骨架，以設計的amiRNA序列替代原有的miRNA 319a序列作為amiRNA的前體，轉入擬南芥，成功抑制了MYB28基因的表達。根據試驗結果對amiRNA的設計、表達載體的構建及應用等進行了討論。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）生態型為Columbia（Col-0），種子萌發后置于培養室中培養，培養條件為溫度20℃，相對濕度70%，光照強度100 μmol/m2/s，光周期16/8 h/d。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株為Top10，農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株為LBA4404，植物表達載體為pCAMBIA230035Su，以上實驗材料均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 amiRNA的設計 為了使amiRNA 技術得到廣泛應用，Schwab等［11］開發了基于網頁的amiRNA 在線設計系統WMD（Web microRNA designer，http：// wmd3.weigelworld.org）。WMD系統參照植物物體內自然miRNA的主要特點［15］，確定了amiRNA設計的一系列原則，根據已公布的轉錄本和EST數據庫，可為不同物種的已知mRNA、未做注釋的轉錄本及外源基因設計amiRNA。通過WMD3系統，我們針對MYB28的編碼序列進行了amiRNA的設計。在WMD3系統“Designer”窗口的“Target genes”框中輸入MYB28的序列編號：AT5G61420.1，選擇擬南芥的基因組數據庫，設計出一系列候選的amiRNA序列，從中選取得分較高的、分別靶向于MYB28編碼序列3'端、5'端和中間部分的amiRNA，分別命名為amiRNA1，amiRNA2和amiRNA3（序列和分析見2.1）進行后續試驗。

amiRNA前體序列采用擬南芥miRNA319a前體為基本骨架，miRNA319a前體序列從mirbase數據庫（http：//www.mirbase.org）［16］獲得，將miRNA319a/ miRNA319a*分 別 替 換 為amiRNA1/amiRNA1*，amiRNA2/amiRNA2*和amiRNA3/amiRNA3*，得到的3個amiRNA前體序列，長度均為370 bp，由南

京金斯瑞生物科技有限公司合成獲得。

1.2.2 amiRNA前體的克隆及植物表達載體的構建 將植物表達載體pCAMBIA2300參照Nour-Eldin等［17］的方法進行改造，使其成為具有萬能接頭的植物表達載體pCAMBIA230035Su，在amiRNA前體的兩側設計一對引物5'-ggcttaaUGCAGCCCCAAACACACG-3'和 5'-ggtttaaUTGTCACTTAGTGGATCAAGC ATG-3'分別以人工合成的3個amiRNA前體DNA為模板，將PCR擴增獲得的amiRNA1、amiRNA2和amiRNA3前體分別連入pCAMBIA230035Su，獲得由組成型啟動子35S驅動的過量表達amiRNA的植物表達載體，35S∷amiRNA1，35S∷amiRNA2和35S∷amiRNA3（圖2）。

圖2 35S：amiRNA植物表達載體構建示意圖

1.2.3 外源基因轉化擬南芥及轉基因植株的篩選 利用農桿菌介導的花序浸染法［18］將構建好的3個植物表達載體分別轉入Col-0生態型擬南芥中，T0代種子播種在含有50 mg/L卡那霉素的1/2MS培養基上，篩選抗性植株。

1.2.4 轉基因植株的分子檢測 將卡那霉素篩選獲得的抗性植株在四葉期時移栽到由蛭石與黑土1∶1的混合土中，一段時間后取擬南芥T1代抗性植株葉片，用DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）提取基因組DNA。根據3個amiRNA的序列設計特異的上游檢測引物，根據載體上的序列設計下游引物（序列見表1的amiRNA1，amiRNA2，amiRNA3），進行PCR檢測，確定抗性苗中amiRNA1，amiRNA2和amiRNA3是否整合入基因組中。

1.2.5 轉基因植株中amiRNA表達水平的檢測 用RNA提取試劑盒（Easy Pure Plant RNA Kit）分別提取野生型和PCR檢測為陽性的轉基因植株葉片總RNA，采用BioTeke supermoⅢ反轉錄試劑盒以OligodT為引物進行逆轉錄合成cDNA，以此為模板擴增內參基因ACTIN2，將所有樣品的RNA調節至相同濃度，用于后續RT-PCR分析。由于成熟miRNA的長度僅為20 nt左右，無法用常規RT-PCR進行檢測，amiRNA表達水平的檢測參照Varkonyi-Gasic等［19］的Stemloop RT-PCR 法，根據amiRNA1，amiRNA2和amiRNA3的序列分別設計了莖環引物 Stemloop RT-1，Stemloop RT-2和 Stemloop RT-3（序列見表1）對總RNA進行逆轉錄，然后用引物amiRNA1RT，amiRNA2RT和amiRNA3RT（序列見表1）對成熟amiRNA的表達量進行RT-PCR分析。

1.2.6 轉基因植株中amiRNA對靶基因MYB28的影

響 用RNA提取試劑盒分別提取野生型和PCR陽性擬南芥葉片總RNA，以OligodT為引物合成cDNA的第一條鏈，并以此為模板來進行半定量PCR檢測MYB28的表達水平，引物設計在amiRNA剪切位點的兩側（引物序列見表1）。同時對MYB28調控的下游基因脂肪族芥子油苷側鏈延長酶基因BCAT4，MAM1和中心結構合成酶基因CYP79F1的表達水平也進行了分析。

表1 PCR檢測引物序列

為了定量分析MYB28表達水平的變化，對MYB28進行了實時熒光定量PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）（引物見表1），以ACTIN2為內參基因。實時熒光定量PCR采用比較CT法（ΔΔCT），以野生型擬南芥作為參照因子，通過2-ΔΔCT方法計算，每個基因做3次生物學重復，3次技術重復，數據取3次重復的平均值［20］。

2 結果

2.1 amiRNA序列的確定

通過WMD3系統，獲得了靶向于MYB28基因序列的一系列amiRNA序列，WMD3系統根據amiRNA設計的多項參數標準對所設計的序列進行了評價，我們按照這些amiRNA的優劣順序選擇了3個分別靶向于MYB28序列3'端、5'端和中間區域的amiRNA，以確定amiRNA的效率是否與結合位點有關，分別命名為amiRNA1，amiRNA2和amiRNA3，三者與MYB28 基因的結合及剪切位點如圖3，3個amiRNA的序列見圖4。

圖3 三個不同的amiRNA與靶基因的結合部位及剪切位點

所選的3個amiRNA符合如下條件：在2-12位只有一個錯配，10-11位是剪切位點沒有錯配，13位后的區域沒有連續錯配，在3'端引入了一個錯配。3個amiRNA前體均以miR319a前體為基本骨架，包含莖環結構兩端一定長度的側翼序列，將miR319a分別替換為amiRNA1，amiRNA2和amiRNA3，前體的總長度為370 bp，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成完整的amiRNA前體序列。

圖4 miR319a及amiRNA前體莖環結構的部分序列

2.2 amiRNA前體序列的克隆與載體構建

以人工合成的3個amiRNA前體DNA為模板，以amiRNA前體兩側序列為引物擴增出目標片段，長度在370 bp左右（圖5）。將PCR擴增獲得的amiRNA1、amiRNA2和amiRNA3前體分別連入pCAMBIA230035Su，獲得由組成型啟動子35S驅動的過量表達amiRNA的植物表達載體。將獲得的植物表達載體轉入大腸桿菌中，挑取陽性菌落進行測序，結果顯示插入序列與設計的序列一致。

圖5 amiRNA前體的PCR擴增

2.3 轉基因植株的分子檢測

利用農桿菌介導的花序浸染法將構建好的植物表達載體轉化野生型擬南芥，隨機選取amiRNA1、amiRNA2、amiRNA3轉基因植株中具有卡那霉素抗性的植株進行PCR檢測，預期的擴增長度為700 bp，以野生型擬南芥為陰性對照，圖6是部分轉基因植株的PCR檢測結果，9株轉基因植株中有7株檢測出了預期的700 bp左右的特異條帶，說明amiRNA前體已經成功地整合至擬南芥的基因組中。

圖6 部分轉基因植株的PCR檢測

2.4 轉基因植株中amiRNA表達水平的檢測

為了檢測轉基因植株中是否具有amiRNA（成熟體）的過量表達，本試驗對野生型和PCR檢測為陽性的轉基因擬南芥隨機取樣進行了半定量RT-PCR分析，結果表明，3種amiRNA在野生型植株均沒有表達，而在轉基因植株中轉入的amiRNA均有明顯的表達。說明amiRNA1，amiRNA2和amiRNA3的前體轉入擬南芥后可被成功地加工形成成熟的amiRNA。

圖7 轉基因植株中amiRNA表達水平的分析

2.5 amiRNA對靶基因沉默效應的檢測

為了檢測amiRNA對靶基因的沉默效率，對35S∷amiRNA1，35S∷amiRNA2和 35S∷amiRNA3植株中MYB28的表達水平進行了半定量RT-PCR分析，結果（圖8）顯示轉基因植株中MYB28的表達量與野生型相比顯著降低。然后通過實時熒光定量PCR進一步對MYB28基因進行定量分析，如圖9所示，作用于MYB28基因3'端的35S∷amiRNA1中MYB28的相對表達量平均下降了88%，作用于中間區域的35S∷amiRNA3中MYB28的相對表達量平均下降了86%，作用于MYB28基因5'端的35S∷amiRNA2中MYB28的相對表達量平均下降了84%，說明3個amiRNA在轉基因擬南芥中都可以有效地沉默靶基因MYB28，且靶向于不同位置的amiRNA沉默效率沒有明顯區別。此外，對MYB28調控的下游基因進行半定量PCR檢測，結果表明（圖8），3種不同的轉基因植株中，MYB28調控的下游基因表達水平均顯著降低，證明amiRNA有效地抑制了靶基因MYB28的表達，導致其調控的下游基因表達水平也明顯降低。

3 討論

基因功能缺失突變體是研究基因功能不可缺少的材料。本研究以擬南芥miRNA319a前體為基本骨架設計了3個amiRNA，均成功地抑制了擬南芥轉錄因子MYB28基因的表達，獲得了通過商業渠道無法得到的myb28缺失突變體，有利地證明了amiRNA介導基因沉默的有效性。根據本試驗結果，目的基因雖不能被amiRNA完全敲除，但表達水平比野生型降低了86%，這種顯著的抑制作用對研究基因功能也是有益的。T-DNA插入獲得的突變體往往可以導致基因功能的全部喪失，但對于純合突變體致死的基因則很難應用，利用amiRNA對這些基因進行抑制則有可能解決這個問題。

圖8 amiRNA對MYB28及其下游基因表達的影響

圖9 35S∷amiRNA1，35S∷amiRNA2和35S∷amiRNA 3對MYB28沉默效應的比較

與其他RNAi基因沉默技術相比，amiRNA有其獨特之處。由于amiRNA前體會形成一個長度適當的莖環結構，最終只生成一個amiRNA，對靶基因有很好的特異性，脫靶率大大降低。此外，由于amiRNA與靶基因的結合位點通常有幾個堿基的錯配，因而可以對多個序列相似的基因（如一個家族的基因成員）同時產生沉默效應［21］。因而，利用amiRNA沉默基因不僅具有精準性，同時還具有高效性。

由于生物內源的miRNA通常會結合在靶基因的

3'端，在目的基因序列已知的情況下，amiRNA通常被設計在3'端。我們的研究表明，結合于MYB28基因3'端、5'端和中間位置的amiRNA均可有效抑制基因的表達，且三者沒有顯著差別，因而amiRNA可能不存在位置效應。由于amiRNA與靶基因的結合區域只有20幾個堿基，且沒有明顯的位置效應，因此對于一些序列不完全清楚或只有EST的基因，也可以設計amiRNA來實現基因的沉默。

以擬南芥miRNA前體為基本骨架設計的amiRNA不僅成功地應用于擬南芥的基因沉默，目前也已經成功地應用于番茄和煙草的基因沉默［22-25］，盡管目前還無法證明在其他植物中的有效性，但至少說明miRNA的前體具有一定的保守性，在其他植物（尤其是缺乏試驗驗證miRNA的物種）中應用基于擬南芥miRNA前體的amiRNA具有可行性。對于那些自身具有經試驗驗證的miRNA的植物，以自身的miRNA前體為基本骨架設計amiRNA則為更好的選擇。

鑒于amiRNA的精準性、高效性及應用的廣泛性，amiRNA介導的基因沉默已經越來越廣泛地應用于基因功能的研究或對經濟植物進行遺傳改良。目前，WMD為amiRNA的設計與應用提供的平臺也日趨完善，不論模式植物還是遺傳背景數據不十分完善的非模式植物，均可借助WMD實現amiRNA的設計及后續克隆和遺傳轉化方案的優化，這使amiRNA基因沉默技術變得更加簡便可行，隨著miRNA前體加工機制研究的進一步深入，amiRNA沉默技術的應用將會得到進一步拓展，必將在生物學研究中會發揮更大的作用。

4 結論

本研究以MYB28為靶基因，利用amiRNA沉默技術在MYB28基因序列的3'端、5'端和中間部分分別設計了1個amiRNA，導入擬南芥后利用Realtime PCR方法分別分析了轉基因植株和野生型植株中MYB28的相對表達量。結果表明作用于MYB28基因3'端的amiRNA1轉基因植株中MYB28的相對表達量平均降了88%，作用于中間區域的amiRNA3轉基因植株中MYB28的相對表達量平均下降了86%，作用于MYB28基因5'端的amiRNA2轉基因植株中MYB28的相對表達量平均下降了84%，說明3個amiRNA在轉基因擬南芥中都可以有效地沉默靶基因。

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（責任編輯 狄艷紅）

Study of Gene Silencing by Artificial miRNA

Zhang Xianhe Kong Wenwen Li Yong Li Jing
（Key Laboratory of Agriculatural Biological Functional Genes，College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

Artificial miRNA（amiRNA）is an effective gene silencing technology. The basic principle of amiRNA is based on its biogenesis mechanism. Using endogenous miRNA precursor as a basic framework, miRNA/miRNA* is then replaced by amiRNA/amiRNA*. The produced amiRNA is expected to silence the target gene. In this paper, the basic principle and method of amiRNA construction was introduced. AmiRNAs were designed to the target gene MYB28 as an example. Three amiRNAs respectively target to the 3' terminal region, 5' region and middle region of MYB28 coding sequence were designed. Precursor of miRNA 319a in Arabidopsis thaliana was taken as a framework and miRNA319a sequence was replaced by amiRNAs targeting to MYB28 gene. The expression level of MYB28 in transgenic plants decreased 86%. Based on our experiments, the unique characteristics of amiRNA and its further applications were discussed.

Artificial miRNA RNAi Arabidopsis thaliana Gene silencing

2013-11-08

國家自然科學基金項目（31070265）

張獻賀，男，碩士研究生，研究方向：植物生物工程；E-mail：xhzhang8888@sina.cn

李晶，女，博士，教授，研究方向：植物生物工程；E-mail：lijing@neau.edu.cn