響應面法優化革耳Panus rudis FG-35菌株產漆酶培養基

劉劍 劉君昂 周國英 李河 楊菁

（1.中南林業科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，長沙 410004；2.中南林業科技大學林學院，長沙 410004）

響應面法優化革耳Panus rudis FG-35菌株產漆酶培養基

劉劍 劉君昂 周國英 李河 楊菁

（1.中南林業科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，長沙 410004；2.中南林業科技大學林學院，長沙 410004）

采用Plackett-Burman 設計和響應面分析相結合的方法，對革耳Panus rudis FG-35菌株產漆酶的液體培養基配方進行優化。單因素試驗結果顯示，發酵培養基中的最優碳源為可溶性淀粉，最優氮源為蛋白胨；Plackett-Burman 設計篩選出影響漆酶產量的 3 個重要因素為可溶性淀粉、金屬Ca2+離子和吐溫-40，在此基礎上運用最陡爬坡試驗逼近最大響應值區域，最后利用Box-Behnken試驗設計及響應面分析法進行回歸分析，獲得最佳培養基配方為：可溶性淀粉 10.040 4 g/L、蛋白胨 0.2 g/L、K2HPO41.00 g/L、ZnSO4·7H2O 0.008 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CuSO4·7H2O 0.007 g/L、FeSO4·7H2O 0.005 g/L、MnSO40.035 g/L、CaCl20.081 6 g/L、VB10.1 g/L、吐溫-40 0.428%。在優化后的條件下搖瓶發酵產漆酶酶活力為263.31 U/mL，與模型預測值接近，發酵產酶量比優化前提高1.07倍，同時優化后的發酵液對木質素降解進行試驗發現，優化后漆酶對木質素降解率提高了14.34%。

漆酶 Plackett-Burman設計 響應面 降解

漆酶是最早被研究的酶類之一。日本學者Yoshida首次發現，但研究者對漆酶了解并不多，直到1894年才有學者將其命名為“漆酶”。目前，漆酶已在生物制漿、生物漂白、污染物生物降解、生物檢測、工業廢水處理等領域廣泛應用，但漆酶的產量一直不高，滿足不了工業發展的需求，因此

有關漆酶的研究日益受到研究者的關注［1-3］。目前產漆酶的菌株大部分為真菌，由于真菌生長時間長、產酶低等問題，使漆酶的產量難以滿足工業的需要。因此，對于如何選育開發產漆酶的新菌種及培養方式顯得極為關鍵［4］。篩選設計（Plackett-Burman design）是通過數學原理利用最少的試驗次數從眾多因素中篩選出對響應值產生重要影響的因素［5］。響應面分析法（Response surface methodology，RSM）是通過篩選試驗設計、最陡爬坡試驗設計、Box-Behnken試驗設計等過程篩選出影響顯著的因子及水平，再通過建立回歸擬合方程使響應值最接近最高值［6，7］。近年來響應面分析法已被廣泛應用于菌株代謝產物的研究中，但對漆酶的響應面優化主要集中在黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、雜色云芝（Coriolus versicolor）和毛栓菌（Trametes trogii）等白腐菌的研究［8-12］，而對于其他優良產漆酶菌株研究很少。因此，本研究采用響應面法對革耳菌產漆酶的培養基進行優化及利用優化后的發酵液對竹材木質素進行降解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 革耳（Panus rudisFG-35），本實驗室篩選自湖南省攸縣黃豐橋國有林場天然竹林腐爛的竹材中，保存于中國典型微生物保藏中心（中國武漢）。

1.1.2 培養基及培養方法 斜面培養基：采用基礎PDA培養基。基礎液體培養基：參考文獻［13］略有改動。

1.1.3 試劑 試驗所需的主要試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 漆酶活力的測定

1.2.1.1 粗酶液的制備 將發酵液經4 000 r/min，4℃條件下離心10 min得到的上清液即為粗酶液，冰箱4℃保存備用。

1.2.1.2 漆酶活力測定 漆酶活力測定采用ABTS法參考文獻［14］，并稍加改動。

1.2.2 產漆酶培養基的單因素試驗

1.2.2.1 不同碳源對產漆酶的影響 在基礎液體培養基中分別添加1% 碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、羧甲基纖維素鈉、淀粉和玉米粉）為菌株的碳源，于 28℃、160 r/min 的條件下培養7 d后測定漆酶活性。

1.2.2.2 不同氮源對產漆酶的影響 在基礎培養基中分別添加0.2% 氮源（蛋白胨、酵母膏、牛肉粉、酒石酸銨、氯化銨、尿素和豆粕粉）為菌株的氮源，于28℃、160 r/min 的條件下培養7 d后測定漆酶活性。

1.2.3 培養基優化試驗設計

1.2.3.1 Plackett-Burman篩選顯著因素 Plackett-Burman的設計是基于數學原理設計而成的，它利用最少的試驗次數從眾多的考察因素中篩選出對目標影響最為重要的幾個因素［15］。根據革耳菌生長所必需的營養要素選取影響漆酶活力的8個因素，選用n=16的試驗設計，確定各因素對革耳菌FG-35產漆酶的影響顯著性。各因素取兩個水平，高水平和低水平分別是（+）和（-）。

1.2.3.2 最陡爬坡試驗 如果響應面的擬合方程不在考察區間的臨近區域里，那么擬合方程就毫無意義。只有響應面的擬合方程在考察的臨近區域內才能建立有效的響應面的擬合方程［16］。最陡爬坡是通過試驗值的變化來確定爬坡方向，根據各因子的變化大小來判定變化步長的大小，從而更快、更有效的接近最有效的產酶條件區域［17］。

1.2.3.3 Box-Behnken確定顯著因素的最佳水平 響應面法中的試驗設計（Box-Behnken design）通常是通過利用連續的變量而建立起的曲面模型，用來確定最佳因素的最適水平及相互作用，通常被應用在各種優化過程中［17］。通過Minitab 軟件設計一個3因素3水平共15個試驗點的試驗。

1.2.3.4 響應面模型的驗證 以響應面設計預測的最佳產酶條件，同時對菌株進行3組產酶試驗，測定酶活，與模型的預測值進行比較，驗證模型的有效性。

1.2.4 漆酶降解竹材木質素 將經預處理的竹纖維1 g，放入含有120 mL經優化的培養基500 mL三角瓶中。接入相同大小的3個1 cm的菌餅。于28℃恒溫培養箱中培養7 d，每隔10 d重新添加一次液體培養基，連續3次，30 d后沖洗、烘干處理后的纖維并對竹纖維的纖維素和木質素含量進行測定，以不加菌種的為空白對照（每組3個重復）。

1.2.4.1 失重率測定 失重率（%）=（處理前樣品重-處理后樣品重）/處理前樣品重×100%

1.2.4.2 木質素和纖維素含量測定 纖維素含量采用過濾法；木質素含量測定采用硫酸法（Klason法），由中國農業科學院麻類研究所測得。

2 結果

2.1 產酶培養基的單因素試驗

2.1.1 菌株產漆酶培養基最佳碳源的確定 從圖1可以看出，由7種不同的碳源為菌株的唯一碳源時，當菌株以可溶性淀粉為碳源時漆酶活性明顯比其他6種物質的酶活高；其次依次為麥芽糖、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、乳糖、玉米淀粉和蔗糖，其中菌株以蔗糖為碳源時漆酶酶活性最低，因此選取可溶性淀粉作為菌株產漆酶培養基的最佳碳源。

圖1 碳源對菌株FG-35產漆酶的影響

2.1.2 菌株產漆酶培養基最佳氮源的確定 由圖2可見，在7種不同氮源為菌株的唯一氮源，其中蛋白胨為氮源時漆酶活性最高，明顯高于其他6種物質，同時發現蛋白胨、酵母膏、牛肉粉等有機氮源明顯比酒石酸銨、氯化銨和尿素等無機氮源的酶活高，說明菌株利用有機氮能更有利于漆酶的產生，因此選取蛋白胨為菌株產漆酶培養基的最佳氮源。

圖2 氮源對菌株FG-35產漆酶的影響

2.2 Plackett-Burman篩選影響產漆酶因素

在確定最佳碳源和氮源的基礎上，以淀粉、蛋白胨、CuSO4·7H2O、MnSO4、ZnSO4·7H2O、CaCl2、吐溫-40（T-40）及藜蘆醇8個因素作為產漆酶的考察因素進行試驗，通過Minitab軟件創建一個N=16的篩選試驗設計表。通過對表1進行數據整理分析，得到各因素對產漆酶的影響效應（表2），同時利用Minitab軟件制作影響因素效果圖（圖3）。通過圖3可直觀地看出各因素影響產漆酶效應的重要性。該圖可以清晰的顯示一條在α=0.05水平下P值的標準化效應值為2.365的參考線，任何只要超過此參考線的影響因素都可能是顯著的。由圖3看出，CaCl2、淀粉和T-40對產漆酶的影響均較顯著，可信度＞95%，其他因素對于漆酶不產生顯著性影響。由表2看出，其中只有淀粉對菌株產漆酶具有顯著正效應，而CaCl2和T-40對于菌株產漆酶有顯著負效應。

2.3 最陡爬坡試驗結果

根據2.1 PB試驗所得的結果（表2）來確定顯著因素的效應決定各因素的爬坡方向和變化步長，淀粉效應系數為正，表明增大淀粉的量對產漆酶的效應為正；反之，CaCl2和Tween-40效應系數為負，表明減少CaCl2和Tween-40的量對產漆酶的效應為正，依據系數的變量確定試驗的基本步長。而對于不顯著因素，根據表現效應的正負來確定不顯著因素的高水平和低水平。最陡爬坡試驗結果（表3）顯示，4號處理組中漆酶活力最高，即當可溶性淀粉（11 g/L）、CaCl2（0.08 g/L）、T-40（0.4%）時，在最高產酶的最優點附近，因此，以第4組的水平選為中心點對革耳菌的產漆酶培養基進一步的優化。

2.4 響應面分析結果

利用Minitab軟件設計一個以爬坡試驗的處理4為中心點的3因素3水平Box-Benhnken 試驗，其中設3個中心試驗點，12個分析點。設計影響漆酶響應面的各因素和水平見表4，試驗結果見表5。同時利用軟件Minitab 16 對表6試驗數據進行二次多項式回歸擬合分析，獲得以漆酶酶活力為預測值的多元二次線性回歸方程如下：

表1 篩選試驗設計與結果

表2 Plackett-Burman設計的因素與水平

圖3 各因素影響效果的排列圖

表3 最陡爬坡試驗及結果

表4 Box-Behnken試驗設計因素與水平

對上述結果進行方差分析（表6）。從表6可看出，在α=0.05的顯著水平上，C、A2、B2、C2、BC的影響水平顯著，其余項對于漆酶的影響不顯著。通過表6看出，回歸方程的P值=0.003，達到顯著水平，說明回歸模型顯著，而失擬項的P值為0.876，說明失擬項不顯著，表明其他因素對于漆酶試驗結果的干擾很小，說明方程與實際試驗有很好的擬合，模型設計適合。而模型的決定系數R2=0.948 1直接說明培養基中的可溶性淀粉、CaCl2和T-40對革耳FG-35產漆酶有94.81%的擬合度。

通過Minitab 16軟件作出各因素交互作用對漆

酶酶活影響的響應曲面和等高線圖（圖4-圖6）。圖4和圖5的響應面圖顯示，隨著培養基中可溶性淀粉濃度的增加漆酶的產量逐漸增加，在可溶性淀粉濃度接近10.040 4 g/L左右，漆酶產量最大，當濃度超過10.040 4 g/L后，漆酶產量逐漸降低；圖6的響應面顯示，當CaCl2和T-40相互作用時，對于漆酶的產量有很顯著的影響，當CaCl2和吐溫-40的濃度在0.816 g/L和0.428 g/L時漆酶產量達到最高。

表5 Box-Behnken 設計及試驗結果

表6 二次多項式方差分析

圖4 淀粉與CaCl2交互影響酶活力的響應面圖及等高線

為了求得培養基最佳濃度，利用Minitab 16軟件獲得非線性回歸模型和響應面后，對回歸方程的每個變量求一階偏導數，得到Y的極大值在：A=10.040 4 g/L，B=0.816 g/L，C=0.428 g/L時，即得到最大產漆酶值，綜合以上得到革耳菌產漆酶的最佳培養基為：可溶性淀粉 10.040 4 g/L、蛋白胨0.2 g/L、K2HPO41.00 g/L、ZnSO4·7H2O 0.008 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CuSO4·7H2O 0.007 g/L、FeSO4·7H2O 0.005 g/L、MnSO40.035 g/L、CaCl20.081 6 g/L、VB10.1 g/L、吐溫-40 0.428%。

通過對最優培養基的模型進行驗證，進行3次驗證試驗，結果試驗的產酶量分別為259.811、262.489和266.129 U/mL，平均值為263.31 U/mL，與模型的預測值基本一致，因此可以說明該模型能較好的預測實際產酶情況。而未優化條件前測得的酶活力為127.194 U/mL，因此優化后漆酶的活力比未優化的酶活力提高了1.07倍。

圖5 淀粉與T-40交互影響酶活力的響應面圖及等高線

圖6 CaCl2與T-40交互影響酶活力的響應面圖及等高線

2.5 降解竹材木質素結果

經過竹材木質素降解試驗后的樣品的失重率、木質素降解率和纖維素降解率結果（表7）表明，通過與空白對照組比較發現，優化后處理組降解木質素后對竹材木質素的降解率達21.69%，比未優化的培養合基的木質素降解率提高了14.34%，因此可以說明經培養基優化后漆酶的提高對木質素的降解有很好的促進作用。

表7 漆酶對木質素降解的影響

3 討論

在研究菌株的代謝產物中，通常優化培養基的方法有兩種：一種是利用確定每個單因素的影響得到菌株的最佳生長條件，而各因素間的相互作用被忽略，因此得到的培養基不是最佳的優化條件；另一種是通過科學合理的設計并同時考慮幾個因素對菌株生長的影響，尋找最佳的各因素水平組合，但正交實驗不能得到回歸方程，從而無法對影響菌株的因素進行再優化［18］。而響應面分析法卻克服了正交實驗無法使各影響因子達到最優組合的狀況，從而使優化的因子更趨近于最優。目前很多研究者［19-22］通過中心設計和響應面法在優化培養基及優化工藝中取得了很好的效果。而本研究通過響應面分析法，以漆酶產量為響應值，采用多元二次回歸擬合方程，并通過求得的偏導數得到顯著影響因子。培養基為菌株生長、繁殖、代謝提供不可或缺的營養物質，對了解菌株的生理生化特性有非常重要的影響。因此篩選出優良的木質素降解菌株后，對菌株培養基及培養條件的研究顯得尤為重要。故本研究

首先通過單因素試驗確定革耳Panus rudis FG-35菌株產漆酶最佳的氮源為可溶性淀粉，產漆酶的最佳氮源為蛋白胨。在單因素試驗的基礎上，首先通過Plackett-Burman試驗從眾多的影響因素中篩選出對革耳Panus rudisFG-35菌株生長和產酶影響顯著的因素。同時在Plackett-Burman試驗、爬坡試驗的基礎上，對淀粉、CaCl2和T-40 3個主要影響漆酶產生的因素進行Box-Behnken試驗設計，建立影響產漆酶數學模型，并通過統計學方法對模型進行顯著性分析，找出使模型達到最大值時各因素的水平，得出革耳Panus rudisFG-35菌株產漆酶的最佳培養基。

通過利用經過培養基優化后的發酵液對竹材木質素降解，使竹材木質素的降解率提高了14.34%，說明漆酶產量的提高對于木質素的降解有很好的促進作用，而對纖維素無明顯的降解作用。通過這一特性可在今后嘗試利用不斷添加補料或替換發酵液方法使竹材的木質素得到進一步充分降解，為將來研究微生物提取竹原纖維提供借鑒和參考。

4 結論

通過響應面法對革耳FG-35菌株產漆酶培養基進行優化，優化后漆酶活力最大值比原始培養基提高了1.07倍，為263.735 U/mL。得到了革耳FG-35菌株的最佳產漆酶培養基配方；經培養基優化后漆酶的提高對木質素的降解發現，優化后的發酵液對使竹材木質素的降解率提高了14.34%。

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（責任編輯 狄艷紅）

Optimization of Components for Laccase Production by Panus rudis FG-35 Using Response Surface Methodology

Liu Jian Liu Jun’ang Zhou Guoying Li He Yang Jing
（1. The Key Laboratory for Non-wood Forest Cultivation and Conservation of Ministry of Education，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004；2. College of Forestry，Central South University of Forestry ＆ Technology，Changsha 410004）

We optimized the liquid medium components to produce the laccase activity of Panus rudis FG-35 by using Plackett-Burman design and response surface methodology. The results of single-factor test showed that soluble starch and peptone were the best sources of carbon and nitrogen. Then the Plackett-Burman design was applied to determine the specific medium components affecting laccase activity and found that soluble starch, Ca2+and Tween-40 were the key factors. Based on these results, steepest ascent experiments were applied to find central points of laccase activity. These significant parameters were further optimized using Box-Behnken design, response surface methodology and regression analysis. Finally, the optimal medium was：soluble starch 10.040 4 g/L, peptone 0.2 g/L, K2HPO41.00 g/L, ZnSO4·7H2O 0.008 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L, CuSO4·7H2O 0.007 g/L, FeSO4·7H2O 0.005 g/L, MnSO40.035 g/L, CaCl20.081 6 g/L, VB10.1 g/L, Tween-40 0.428%. Under these optimal conditions, the activity of laccase increased from 263.31 U/mL to 127.194 U/mL（1.0-fold increase in total yield）, similar to the predictions. And the results of lignin degradation experiments indicated that the optimal medium made contribution to the degradation rate of lignin which about 14.34% improvement over before.

Laccase Plackett-Burman design Response surface Degradation

2014-01-20

湖南省科技重大專項（2011FJ1006），林業公益性行業科研專項經費項目（201004014），中南林業科技大學研究生科技創新基金項目（CX2012B15）

劉劍，男，碩士研究生，研究方向：林業應用微生物；E-mail：408199303@qq.com

周國英，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：林業微生物開發；E-mail：gyzhou2118@163.com