牦牛MC1R基因的多態性研究

陳思柴志欣，2王永，2鐘金城，2

（1.西南民族大學 動物遺傳育種學國家民委-教育部重點實驗室，成都 610041；2.西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041）

牦牛MC1R基因的多態性研究

陳思1柴志欣1，2王永1，2鐘金城1，2

（1.西南民族大學 動物遺傳育種學國家民委-教育部重點實驗室，成都 610041；2.西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041）

旨在為探究牦牛MC1R基因多態性與毛色形成的相關性，利用PCR-SSCP和DNA測序技術，對64頭牦牛（33頭黑色九龍牦牛，31頭白色天祝白牦牛）的MC1R基因多態性進行檢測。結果表明：天祝白牦牛和九龍牦牛均有3種基因型（AA、BB、AB），但天祝白牦牛的多態性較低，而九龍牦牛表現為中度多態。經χ2適合性檢驗，2個牦牛品種在該基因多態位點上均偏離Hardy-Weinberg平衡。測序結果表明BB型與AA型在該片段的第179位堿基處存在C→A單堿基突變；第214位堿基處發生T→C突變。

牦牛 MC1R基因 PCR-SSCP 基因多態性

牦牛（Bos grunniens）是分布于海拔3 000-5 500 m，以我國青藏高原為中心及其毗鄰的高山、亞高山地區的特有牛種之一。我國現有牦牛1 470余萬頭，占世界牦牛總數的95%，占我國牛只總數的1/6，為當地牧民提供奶、肉、毛、役力、燃料等生活生產必需品。其中牦牛毛是傳統特產，產量大，質量好，除供應國內需要外，是我國出口暢銷的畜產品之一，并以白牦牛毛最為馳名。牦牛毛、絨制品深受喜愛，但是由于大多數牦牛為黑色、黑白色和褐色等，顏色較深不易染色，導致牦牛毛制品出現顏色單一，不能滿足廣大消費者的需求［1-3］。因此，從基因水平探究控制牦牛毛色遺傳的主效基因具有重要的意義。

黑色素皮質素受體Ⅰ（melanoccortin receptorⅠ，MC1R）在黑色素細胞中表達MC1R，與天然配體α-促黑素細胞激素（α-MSH）相互作用，經由G蛋白耦合的CAMP信號通路，調節黑色素細胞內的一系列級聯反應，最終經多巴或多巴胺合成各自的衍生物——褐黑素或真黑色素，使動物呈現不同的毛色或羽色［4］。目前，研究表明在人、馬、牛、綿羊、豬、犬、狐貍和鼠等哺乳動物中均發現了MC1R基因的突變與黑色素性狀變異或皮膚癌等疾病有關。且作為影響動物黑色素的重要基因廣泛用于相關研究。本研究選擇兩個不同毛色的牦牛品種為研究對象，應用PCR-SSCP技術對牦牛MC1R基因進行多態性分析，以期為牦牛毛色形成規律的研究提供一些參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康成年的九龍牦牛、天祝白牦牛作為試驗動物（表1），采集耳組織，75%乙醇保存帶回實驗室，-80℃保存備用。

表1 試驗動物、采樣地點及毛色

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及檢測 采用動物組織基因組DNA提取試劑盒（Tiangen生物技術有限公司）提取基因組DNA，用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計雙重檢測DNA的純度和濃度，-20℃保存備用。

1.2.2 引物設計與PCR擴增 根據普通牛MC1R基因組序列（GenBank Accession No：NC_007316），綜合利用軟件primer5.0、Oligo6.0設計引物，覆蓋片段長度為268 bp。引物：PF：5'-GGAGAACGTGCTGGTAGTG-3'，PF：5'-GGGCGTAGAAGATGGAGATG-3'，由上海英駿生物技術有限公司合成，去離子水稀釋（100 pmol/μL），-20℃保存備用。

PCR反應采用25 μL體系：10×TaqBuffer 2.5 μL，dNTP Mixture（10 mmol/L）1.5 μL，上下游引物(10 pmol/mL) 1.0 μL，DNA Template (25 ng/μL) 1.5 μL，TaqPolymerase（5 U/μL）0.25 μL，ddH2O 17.25 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；最后72℃延伸3 min，8℃保存。

1.2.3 PCR產物SSCP分析 采用0.1 g/mL（Arc∶Bis質量比為29∶1，緩沖液為1×TBE）的非變性丙烯酰胺凝膠電泳檢測：取5 μL PCR產物，加入8 μL上樣緩沖液（φ=95%去離子甲酰胺、0.25 g/L二甲苯青、2.5 g/L溴酚藍），98℃變性10 min，立即置于冰浴中放置10 min。變性后的PCR產物，200 V電壓電泳10 min后140 V恒壓電泳4 h，銀染顯帶后，觀察結果。

1.2.4 測序分析 選取純合基因型個體進行克隆測序，運用BioEdit、DNAMAN軟件對測序結果進行校對分析。

1.2.5 統計分析

1.2.5.1 基因頻率及基因型頻率 一個基因座位上具有兩個等位基因的情況下，基因頻率計算公式如下［5］：

p=（2nAA+nBB）/[2（nAA+nAB+nBB）]

q=（2nAA+nBB）/[2（nAA+nAB+nBB）]

其中：p是等位基因A的基因頻率，q是等位基因B的基因頻率，nAA、nAB、nBB分別是群體中基因型AA、AB和BB型的個體數。

1.2.5.2 群體雜合度（Heterozygosity，H） 雜合度，即某一基因位點上等位基因間雜合的程度。平均雜合度是衡量群體內遺傳變異的有效指標。平均雜合度越大，群體內遺傳變異程度越大。雜合度計算公式為：

其中：m為等位基因數，Pi為第i個等位基因頻率。

1.2.5.3 多態信息含量（PIC） PIC用于對標記基因多態性的估計，是表示DNA變異程度的高低的一個指標，PIC＞0.5為高度多態，0.25＜PIC＜0. 5為中度多態，PIC＜0.25為低度多態。PIC可根據Bostein等［6］的公式進行計算。

其中：m為等位基因數目，Pi和Pj分別為第i個和第j個等位基因在群體中的頻率。

1.2.5.4 Hardy-Weinberg平衡檢驗［7，8］檢驗公式為：

其中：Ei：理論值，Oi：實際觀察值，n為等位基因數。

2 結果

2.1 PCR擴增結果

凝膠電泳檢測結果（圖1，圖2）顯示，擴增產物片段大小268 bp左右，與設計的產物大小一致，擴增結果良好，可用于SSCP分析。

圖1 天祝白牦牛PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 九龍牦牛PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 牦牛的PCR-SSCP多態性

對天祝白牦牛、九龍牦牛MC1R基因的擴增片段進行單鏈構象多態性分析，銀染后在凝膠成像系統中的檢測結果見圖3和圖4。

圖3 天祝白牦牛PCR-SSCP檢測

圖4 九龍牦牛PCR-SSCP檢測

2.3 PCR-SSCP結果的測序分析

將天祝白牦牛和九龍牦牛中AA、BB型個體的PCR產物進行克隆測序。序列比對結果發現：BB型與AA型相比在該片段的第179堿基處存在C→A的單堿基突變；在第214堿基處有一個T→C的單堿基突變（圖5）。

圖5 天祝白牦牛與九龍牦牛AA、BB型比對圖

2.4 牦牛品種的遺傳多樣性

在天祝白牦牛和九龍牦牛中均檢測到3種基因型，分別定義為AA型、BB型、AB型（圖3，圖4）。在31頭天祝白牦牛中檢測到15頭AA型、4頭BB型、12頭AB型；在33頭九龍牦牛中檢測到7頭AA型、5頭BB型、21頭AB型。結果（表2）顯示，天祝白牦牛AA型頻率為0.483 9、BB型頻率為0.1290、AB型頻率為0.387 1；九龍牦牛中AA型頻率為0.212 1、BB型頻率為0.151 5、AB型頻率為0.636 4。

天祝白牦牛的雜合度為0.321 2，多態信息含量為0.201 6；九龍牦牛的雜合度為0.498 2，多態信息含量為0.374 1（表2）。按Bostein等提出的衡量基因變異程度高低的多態信息含量指標，天祝白牦牛的多態信息含量為低度多態（PIC＜0.25）；九龍牦牛的多態信息含量為中度多態（0.25＜PIC＜0.5），且雜合度較高，遺傳變異較大。

Hardy-Weinberg平衡的χ2適合性檢驗結果表明，天祝白牦牛的χ2值為6.04，差異顯著，偏離Hardy-Weinberg平衡（P＜0.01）；九龍牦牛的χ2值為11.33，差異極顯著，也不符合Hardy-Weinberg平衡（P＜0.01）。推測這2個牦牛品種在該位點上受到較大選擇、突變等因素的影響。

3 討論

近年來，就MC1R基因遺傳多態性對家畜毛色影響方面，李洪濤等［9］利用PCR-SSCP和實時熒光定量技術研究哈薩克綿羊MC1R和ASIP基因多態性及表達量與被毛顏色表型的相關性，發現MC1R基因的多態位點（P.M73K）與被毛顏色極顯著的相關（P＜0.01）且黑色被毛中MC1R基因的表達量與白色被毛中差異極顯著（P＜0.01），與棕色被毛差異顯著（P＜0.05）。姜俊兵等［10］通過對中國羊駝種群MC1R基因的PCR-SSCP檢測發現AA和AB基因型，且AA基因型均存在于有色被毛羊駝個體中。唐賀等［11］研究發現在文山黃牛、昭通黃牛和短角牛中發現E+和e2種等位基因，檢測到E+/E+、E+/e 和

e/e 3種基因型，而在迪慶黃牛中存在E+/E+、ED/ED、E+/ED、E+/e 和ED/e 5種基因型；與所研究個體的毛色相聯系發現，E+和ED等位基因與黑色表型有關，而e等位基因與紅色表型有關，但黃色、棕色和紅色表型還與其它座位基因相關聯。

表2 牦牛品種MC1R的基因頻率和基因型頻率及遺傳分析

本研究通過PCR-SSCP分析方法顯示，九龍牦牛、天祝白牦牛的MC1R基因部分序列存在多態性。其擴增片段均存在AA、AB和BB 3種基因型，其中A為優勢等位基因。且該片段存在兩個突變位點：179 bp處C→A突變，214 bp處T→C突變，但這些突變在黑色、白色牦牛中均出現。所以該基因的核苷酸及相應蛋白水平上的差異是否導致牦牛毛色的差異，有待進一步深入研究。

從群體遺傳多態性角度分析，多態信息含量和群體雜合度都是對群體內遺傳變異大小的衡量指標。本研究中九龍牦牛的雜合度為0.498 2，多態信息含量為0.374 1，處于中度多態，遺傳變異較豐富，且雜合度較高，選擇潛力大。天祝白牦牛的多態信息含量、雜合度較九龍牦牛的低，說明兩個牦牛品種在MC1R基因該片段上有一定的多態性差異，但多態性水平均較低，這與近年來對這兩個品種在體態外貌、生理生化、細胞（染色體）、分子等不同水平和層次以及生產性能、產區地形地貌、水熱條件等自然和社會生態環境方面的綜合研究和分析結果相吻合，反映了其各自的遺傳特性。卡方適合性檢驗結果表明，兩個牦牛品種在該突變區域均偏離Hardy-Weinberg平衡狀態，說明經過長期的進化和選擇，目前這兩個品種在該位點仍受選擇、突變、遺傳漂變等因素的影響。進一步開展牦牛MC1R基因的相關研究，對深入了解該基因的功能，尋找控制牦牛毛色的深層機理有重要意義。

4 結論

九龍牦牛和天祝白牦牛MC1R基因部分序列存在兩個突變位點，第179位的C→A突變，第214位的T→C突變。群體遺傳學分析顯示九龍和天祝白牦牛均存在遺傳變異。

［1］ 中國畜禽遺傳資源狀況編委會. 中國畜禽遺傳資源狀［M］.北京：中國農業出版社, 2004.

［2］ 《中國牦牛學》編寫委員會.中國牦牛［M］.成都：四川科學技術出版社, 1989.

［3］ 鐘金城.牦牛遺傳與育種［M］.成都：四川科學技術出版社, 1996.

［4］ 湯寧.基因突變檢測方法進展［J］.國外醫學衛生學分冊, 1994（4）：200-203.

［5］ Southern E, Mir K, Shchepinov M. Molecular interactionson microarrays［J］. Nature Genetics, 1999（S）：529.

［6］ Limonen M, Hello T, Ebeling T, et al. Screening mutations in the exon 26 of the applipoprote in B gene in hypercholest-erdmic finnish familes by the single-strand polymorphism method［J］. Human Mutation, 1994, 4：217-223.

［7］ 劉平華, 李奎, 彭中鎮, 等.豬生長激素基因的PCRR-FLP與PCR-SSCP研究概況［J］.畜牧獸醫雜志, 1994（3）：16-18.

［8］ 李鵬飛, 董常生, 杜海燕, 等.黑素皮質素受體1（MC1R）基因與哺乳動物毛色［J］.畜牧獸醫雜志, 2006, 25（1）：21-22.

［9］ 李洪濤, 曾獻存, 張文祥, 等.哈薩克綿羊MC1R和ASIP 基因多態性及表達量與被毛顏色表型相關性的研究［J］.畜牧獸醫學報, 2013, 44（3）：336-375.

［10］ 姜俊兵, 任杰, 于秀菊, 等.中國羊駝種群MC1R基因的PCRSSCP分析［J］.家畜生態學報, 2010, 31（3）：15-18.

［11］ 唐賀, 高英凱, 苗永旺.4個黃牛群體黑素皮質素受體1（MC1R）基因變異研究［J］.畜牧獸醫學報, 2010, 41（6）：639-643.

（責任編輯 馬鑫）

The Polymorphism of MC1R Gene in Yak

Chen Si1Chai Zhixin1，2Wang Yong1，2Zhong Jincheng1，2
（1. Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding，Southwest University for Nationalities，State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Chengdu 610041；2. Institute of Tibetan Plateau Research，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041）

It was to explore the relationship between MC1R genotype and the coat color formation in yak, polymorphism of MC1R gene was detected by PCR-SSCP and DNA sequencing techniques in 64 yaks（33 white coat color and 31 black coat color）. The results showed that there were polymorphisms in the amplified region for the Tianzhu yak and Jiulong yak. In Tianzhu yak and Jiulong yak, three genotypes（AA, BB and AB）were detected. The result of χ2, three yak breeds were not fit for Hardy-Weinberg law. Sequencing revealed on single nucleotide mutation（C→A）at 179bp and（T→C）at 214 bp of the amplified region of Tianzhu yak and Jiulong yak.

Yak MCIR gene PCR-SSCP Polymorphism

2013-11-13

國家科技支撐計劃課題（2012BAD13B06），中央高校基本科研業務費專項資金項目（11NZYTH03）

陳思，女，碩士，研究方向：基因組學與生物信息學；E-mail：swunyak2525@163.com

鐘金城，男，博士，教授，研究方向：動物遺傳學；E-mail：zhongjincheng518@126.com