合作豬SLA-DQA基因外顯子2多態性分析

張國華馬小軍，2呂偉麗

（1.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730037；2. 甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，蘭州 730070）

合作豬SLA-DQA基因外顯子2多態性分析

張國華1馬小軍1，2呂偉麗1

（1.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730037；2. 甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，蘭州 730070）

旨在研究合作豬DQA基因外顯子2多態性，確定其等位基因數、核苷酸多態位點、氨基酸多態位點及各個等位基因之間的遺傳關系，分析其進化意義。選用PCR-SSCP對439只合作豬SLA-DQA基因外顯子2的多態性進行檢測；測序群體內因變異而產生的各等位基因序列，并分析序列數據。結果顯示，在合作豬SLA-DQA外顯子2中發現了7個新等位基因，共18個核苷酸多態位點，10個氨基酸多態位點。合作豬SLA-DQA外顯子2具有較豐富的多態性，群體內可能蘊藏著更加豐富的遺傳資源；合作豬SLA-DQA外顯子2基因最初可能由一個等位基因突變分化成一大類基因；合作豬SLA-DQA外顯子2序列與各個豬種的SLA-DQA外顯子2序列具有較高的同源性，預示著這些豬種的SLA-DQA外顯子2基因最早可能來源于其分歧之前的共同祖先原始序列；新發現的7個SLA-DQA外顯子2等位基因，可能由遺傳關系較近的兩個等位基因突變產生。

合作豬 SLA-DQA外顯子2 多態性 PCR-SSCP

主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）是緊密連鎖、高度多態的基因位點所組成的染色體上的一個遺傳區域，其表達產物分布于各種細胞表面，稱為MHC分子［1，2］。這種遺傳變異改變了肽的編碼蛋白結合位點，使它們能夠結合多種外來多肽［3］。有研究表明，MHC在機體的免疫應答調控與免疫識別過程中有重要作用。MHC作為疾病抗性和易感性基因，其組成、結構和疾病之間的關系成為抗病育種研究的一個重要部分［4，5］。豬的MHC稱為豬白細胞抗原（SLA），位于豬的7號染色體上［6］，SLA的多態性主要集中在基因編碼區的外顯子2，具有高度的多態性和連鎖不平衡，也與豬的抗病力有密切的關系。豬SLA-DQA基因位于豬SLA-classⅡ區的DQ亞區［10］，合作豬DQA基

因外顯子2的遺傳多態性檢測與分析，可為進一步研究該高原豬種MHC的抗病性，高原適應性，抗逆性奠定理論基礎，為更好地利用中國優良的遺傳資源，進行豬抗病、抗逆性的育種研究提供有價值的免疫遺傳學基礎資料。近年來，有關豬MHC-DQA基因的研究報道有所增加，發現其多態性可以增加仔豬斷奶前后的重量和體質［7］；談永松等［8］對NIH小型豬及五指山豬的cDNA序列分析表明，SLADQA基因多態性主要集中在外顯子2；彭永波等［9］研究發現，具有不同SLA-DQA基因型的豬對疾病的抵抗能力存在著差異，且與生長、胴體品質及肉質等性狀有關。高度表達的SLA-DQA外顯子2是SLA中功能最重要的區域，其多態性豐富［1，10］，但是這些研究并未涉及中國合作豬（亦名蕨麻豬或山豬），它是甘肅省甘南藏族自治州特有的地方小型豬種。該品種生長在海拔3 000 m、氣溫最低-28.5℃的高寒潮濕半農半牧區。具有放牧性能強、抗逆性好，不懼暴曬和風雪、體型小、生長較慢、繁殖力低等特點。有關中國合作豬SLA-DQA外顯子2基因的研究，國內外還沒有相關文獻報道。本研究旨在確定合作豬SLA-DQA外顯子2基因的等位基因和多態位點，分析各個等位基因之間的遺傳關系和進化意義，為豬的抗病、抗逆性雜交育種研究奠定分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究在甘南州合作市屠宰場采集合作豬血液樣品192份和耳組織樣品91份，在夏河屠宰場采集合作豬血液樣品156份，用冰盒帶回實驗室，置于-20℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用常規的酚/氯仿提取法，從血樣中提取DNA并溶解于TE緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠，200 V電泳檢測后，放于-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物設計及PCR擴增 采用primer5.0引物設計軟件，根據GenBank發表的蘇太豬SLA-DQA基因核苷酸全序列（AY303988）設計第2外顯子的核苷酸序列引物（上游引物：5'-TCCCTTTGTTGTCACCT-3'，下游引物5'-GCCTGATGTGAACGGGTA-3'），擴增目的片段約為341 bp，引物由大連寶生物有限公司合成。

PCR擴增采用20 μL的體系，各成分用量：上下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.8 μL，滅菌ddH2O26.4 μL，DNA-TAQ預混酶12 μL。

PCR反應條件：預變性95℃ 1 min；變性95℃45 s，退火49℃ 30 s，延伸72℃ 54 s，35個循環；最后延伸72℃ 10 min。4℃保存，PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR產物的SSCP檢測 取2.5 μL PCR產物，7.5 μL變性劑（98%去離子甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.025%溴酚藍、0.5 mol/L混合而成），經105℃變性5 min，然后放置于冰上10 min，在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis=37.5∶1），4℃、240 V，電泳24 h，結束后銀染法顯色。

1.2.4 SLA-DQA外顯子2測序 SSCP分析之后，選取不同基因型個體PCR擴增產物送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.5 數據統計分析 用DNAMAN進行核苷酸變異位點、氨基酸變異位點的分析，系統發育樹的構建；Megalign對所測的合作豬SLA-DQA外顯子2序列進行同源序列比對分析。

2 結果

2.1 PCR擴增

對采集的合作豬樣DQA基因第2外顯子進行擴增，得到341 bp的擴增產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶清晰且無雜物（圖1），可以進行下一步的SSCP分析。

圖1 DQA基因第2外顯子擴增產物電泳圖

2.2 PCR-SSCP檢測結果

PCR擴增產物經SSCP分析，所檢測的439只合作豬中共發現7個等位基因，分別指定為SLA-

DQA*A、*B、*C、*D、*E、*F、*G。各等位基因的電泳帶從2-6條不等，結果如圖2所示。

圖2 DQA 基因第2外顯子SSCP電泳圖譜

2.3 SLA-QDA基因外顯子2多態位點、等位基因頻率與氨基酸差異分析

通過PCR產物測序，共有7個DQA基因第2外顯子單倍型序列被確定（圖3）。對7個DQA基因第2外顯子341 bp單倍型序列進行對比分析，發現18個變異位點（圖3），占分析位點的5.28%。其中轉換位點15個，占變異位點的83.33%，包括G/A的轉換4個，T/C轉換8個，A/C轉換2個，G/T轉換1個。顛換位點3個，占變異位點16.67%。用SLA-DQA基因第2外顯子和部分內含子共341 bp序列推導出的氨基酸序列（圖4），共有10個氨基酸位點發生了突變，其中單一氨基酸突變位點9個。A、F、G等位基因在133 bp處C/T和241 bp處的T/C突變，C等位基因在202 bp處的A/G突變，B、D等位基因220 bp處的C/T突變，E等位基因118 bp處的C/T突變并沒有引起氨基酸的變異。

對測序獲得的7個SLA-DQA基因第2外顯子的等位基因頻率進行統計分析（表1）發現，B等位基因的頻率最高；其次是A等位基因，分別為42.14%和19.14%，為SLA-DQA基因的優勢等位基因。

2.4 SLA-DQA基因第2外顯子序列系統發育分析

為了分析合作豬SLA-DQA基因第2外顯子的等位基因與其他相應的等位基因間的遺傳關系，利用DNAMAN軟件對SLA-DQA基因第2外顯子的序列進行NJ樹的構建（圖5）。所用序列包括本研究獲得的7個單倍型序列，基因庫下載AY285931（尤卡坦豬），AY303988（蘇太豬），AY906855（辛克萊豬），DQ159886（長白豬），DQ159887（大白豬），DQ159892（桐城豬），EU432058（梅山豬），EU477534（五指山豬），FJ905827（甘肅豬）。圖5顯示，豬SLA-DQA第2外顯子在各個品種之間的同源性很高，遺傳關系很近。在新發現的等位基因中，B、D的遺傳關系最近，可能是由同一個等位基因突變而產生的。

3 討論

3.1 合作豬SLA-DQA第2外顯子基因多態性

圖3 SLA-DQA 基因第2外顯子等位基因核苷酸序列比對結果

合作豬是中國古老的豬品種，分布在海拔3 000

m的甘肅省甘南州等地，由于地理等原因，與群體外的基因交流十分有限。在物種進化上，幾乎所有的脊椎動物的MHC的高度多態性是廣泛存在的，并在長期進化過程中被保留下來；MHC的多態性對物種的生存和繁殖都是有利的，一般認為MHC復合體的每一座位基因上均存在眾多的復等位基因，而且這些等位基因均為共顯性［11］。選擇是MHC多態性保持的基本方法［12］，有超顯性選擇、基因頻率的選擇、會聚化與平穩選擇、多樣性選擇及雜化交配，這些選擇的本質全是自然選擇的作用。在沒有考慮選擇的情況下，一般認為MHC的多態性是由于長期進化過程中等位基因的積累、融合與擴增而形成的［13］。劉云芳等［14］認為MHC基因的高度多態性是由MHCⅡ類抗原在免疫系統中的重要功能所決定的，其功能是參加抗原遞呈和免疫調控，這是機體體液免疫的主要調控因素，進而決定了機體適應外界環境的能力。由于各機體所處的環境（地理環境和氣候環境）有很大的區別，所以為了適應所處的環境，其免疫系統具有豐富的多態，因此編碼MHC抗原最主要功能的區域也應該表現出豐富的多態性。本研究在合作豬SLA-DQA基因第2外顯子中發現新等位基因7個，之間存在大量的多態位點，占分析位點的5.28%，說明該基因是多堿基突變，具有高度的多態性。這與合作豬（與平原豬種和國外品種所處的地理環境和氣候條件存在較大差異）生活在高原這種比較惡劣的環境下所形成的適應性強，抗逆性好，生長緩慢等特點相一致。合作豬新等位基因的出現，可能與國內平原豬種和國外豬種所處地理環境和氣候環境的惡劣程度不同有一定的關系。

圖4 SLA-DQA 基因第2外顯子等位基因氨基酸序列對比結果

表1 合作豬SLA-DQA基因第2外顯子各等位基因頻率

圖5 SLA-DQA基因第2外顯子核苷酸序列的系統進化樹

動物MHC與疾病的易感性和抗性有關系［15］。SLA-DQA基因的多態性和遺傳性是為了保護機體組織對疾病的感染［11］。免疫學研究揭示，采用免疫遺傳標記開展選種工作，可以提高畜禽的抗病力［16，17］。在哺乳動物的抗病育種中，MHC基因是已經被多項研究證實的一組重要的候選基因［4，18，19］，合作豬抗病性強，抗逆性好，其在這方面的基因優勢可以用于豬的抗病分子育種實踐之中。通過合作豬SLADQA基因外顯子2 PCR-SSCP分析，新發現的7個等位基因，表明在合作豬群體之中蘊藏著豐富的遺傳多態性，是寶貴的遺傳資源。

3.2 SLA-DQA基因外顯子2系統發育

合作豬SLA-DQA基因外顯子2序列系統發育分

析表明，合作豬SLA-DQA基因外顯子2遺傳關系較近，很可能是由同一個基因突變分化而來。系統發育也表明合作豬SLA-DQA基因外顯子2和國內平原豬種和國外品種的SLA-DQA基因外顯子2有著較高的同源性。表明合作豬和其他豬種的SLA-DQA基因外顯子2最早可能來自于它們分歧之前的共同祖先序列。機體對所處的地理環境和氣候環境的適應可能會提供選擇壓力來維持MHC特殊的序列［20］，各豬種之間具有比較相似的SLA-DQA基因外顯子2基因序列，而之間的差異很可能就是因為各自所處環境的差異而造成的。7個新等位基因可能由遺傳關系較近的兩個等位基因突變產生。

4 結論

研究獲得了7個合作豬SLA-DQA基因外顯子2等位基因，說明合作豬SLA-DQA基因外顯子2具有較為豐富的多態性。合作豬SLA-DQA基因外顯子2最初由同一個等位基因突變分化而來。合作豬和其他豬種的SLA-DQA基因外顯子2具有較高的同源性，預示著它們的SLA-DQA基因外顯子2最早可能來源于分歧之前的共同祖先的原始序列；SLA-DQA基因外顯子2隨地理環境和氣候環境的改變而出現差異。

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（責任編輯 馬鑫）

Analyzing Polymorphism of SLA-DQA Gene Exon 2 in the Hezuopig

Zhang Guohua1Ma Xiaojun1，2Lü Weili1
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730037；2. Gansu Key Laboratory of Herbivorpous Animal Biotechnology，Lanzhou 730070）

The polymorphism, allele number, nucleotide polymorphism sites, amino acid polymorphism sites, the genetic relationship and evolutionary significance of the alleles of the SLA-DQA gene exon 2 in Hezuo pigs were studied. Variation of SLA-DQA gene in the 439 Hezuopigwas investigated by amplification of exon 2 using PCR, followed by single-strand conformational polymorphism（SSCP）, DNA sequencing and sequence data analysis. Result showed that seven alleles were found in the SLA-DQA geneexon 2. Eighteen nucleotide polymorphism sites and ten amino acid polymorphism sites were identified in seven SLA-DQA gene exon 2 haplotypes. The study indicated that a high level of sequence polymorphism existed in SLA-DQA gene exon 2 of Hezuo pigs, and the population might have more genetic resources. SLA-DQA gene exon 2 in Hezuo pigs might be differentiated into two major categories alleles from one mutant alleles at first. SLA-DQA gene exon 2 in Hezuo pigs and other pig had high homology, which indicated that SLA-DQA gene exon 2 in pig might come from primordial sequences that were present in a common ancestor and persisted in the pig populations since their divergence. Seven new alleles that had near genetic relationship, may came from the two near allele by mutation.

Hezuopig SLA-DQA gene exon 2 Polymorphism PCR-SSCP

2013-10-30

甘肅省自然科學基金項目（096RJZA005）

張國華，男，碩士研究生，研究方向：動物免疫與抗病；E-mail：664802394@qq.com

馬小軍，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：動物免疫與抗病；E-mail：maxj712@163.com