貴州三個地方豬種的系統發育分析

丁玫陳祥許厚強吳通貴馮文武柏琳

（1.貴州大學動物科學學院 高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州省生豬健康養殖工程技術研究中心，貴陽 550025；3. 施秉縣畜禽品種改良站，凱里 556200）

貴州三個地方豬種的系統發育分析

丁玫1，2陳祥1，2許厚強1吳通貴3馮文武1柏琳1

（1.貴州大學動物科學學院 高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州省生豬健康養殖工程技術研究中心，貴陽 550025；3. 施秉縣畜禽品種改良站，凱里 556200）

采用PCR產物直接測序方法首次測定貴州3個地方豬種（白洗豬、從江香豬、黔北黑豬）共計57個個體線粒體DNA控制區的全序列，將它們與GenBank上已知的25個國內外豬種一起計算遺傳距離，并構建系統發育樹。結果表明，3個貴州地方豬種mtDNA D-loop區的序列長度為1 254-1 314 bp之間，貴州地方豬種遺傳距離在0.002 9-0.007 2之間，白洗豬與黔北黑豬、從江香豬之間的距離最大，均為0.007 2。系統發育分析的結果支持中國家豬分別有南北兩個母系起源的觀點，且各地方豬種之間可能有基因交流。

mt DNA D-loop 遺傳距離 地方豬種 系統發育

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是動物體內唯一的核外遺傳物質，其分子為共價、閉合、環狀結構，具有分子量小、進化速度快（為單拷貝核基因的5-10倍）、遺傳上具有自主性及嚴格的母系遺傳等特性［1］。D-loop為mt DNA的控制區，位于tRNA-Pro 和tRNA-Phe 的基因之間，是整個線粒體基因組序列和長度變異最大的區域，其進化速度最快，廣泛應用于哺乳動物群體遺傳多樣性和種內、種間親緣關系等方面的研究［2，3］。近年來，也有一些應用D-loop區研究豬的遺傳多樣性及系統發育地位的相關報道。孫俊麗等［4］研究了陸川豬mtDNA D-loop高變區，表明陸川豬具有較高的遺傳多樣性；茍瀟等［5］測定了云南4個地方豬品種的D-loop區的高變區，結果顯示mtDNA多態能有效作為品種內遺

傳多樣性指標及云南4個地方豬品種大多數個體起源于一個野豬亞種［5］。

白洗豬、從江香豬和黔北黑豬是貴州優良的地方豬種資源，具有地方豬種共有的特性：繁殖力好、抗逆性好、肉質好等優良種質特性，目前還未見有關其mtDNA D-loop的研究報道。本研究首次通過PCR擴增白洗豬、從江香豬、黔北黑豬3種貴州地方豬種的線粒體D-Loop 區全序列，結合NCBI已登錄的其他豬種mtDNA D-loop序列，基于D-loop區的高變區構建系統發育樹，從分子遺傳的角度探討3個貴州地方豬種的遺傳分化地位，為白洗豬、從江香豬和黔北黑豬的保種和選育積累基礎的遺傳資料。

1 材料與方法

1.1 材料

30頭白洗豬耳組織樣采于貴州省施秉縣楊柳塘鎮；14頭從江香豬血樣采于“貴州大學香豬育種場”；13頭黔北黑豬肉樣遵義市黔北黑豬繁育中心。血液基因組DNA抽提試劑盒、動物基因組DNA抽提試劑盒、2×Es Taq MasterMix等為上海生工生物工程公司產品。

所用24種國內外豬種線粒體DNA D-loop序列由NCBI下載，見表1。宗地花豬DNA D-loop序列，引自文獻［6］。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取、PCR擴增及測序 采用組織基因組DNA抽提試劑盒及血液基因組DNA抽提試劑盒分別提取白洗豬、黔北黑豬和從江香豬的基因組DNA。根據GenBank已報道的豬mtDNA全序列（登錄號：AJ002189）由Premer Primer5設計引物，序列為：P1：5'-GGCCCATCTAGGCATTTTC-3'，P2：（5'-CCCCTCCCCAAGACTCAAG-3'，由上海生工生物工程公司合成。PCR反應體系：模板DNA 2.5 μL、引物（10 pmol/L）各2.5 μL、ddH2O 17.5 μL、MIX試劑 25 μL；條件：95℃預變性10 min、95℃變性40 s、59℃退火40 s、72℃延伸1 min，35個循環，72℃充分延伸10 min，4℃保存。PCR產物檢測后，委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進行小量膠柱式回收、純化和序列測定。

1.2.2 數據分析處理 應用DNAstar軟件包參考豬mtDNA序列對所有測序結果進行編輯、比對和人工校正，確定所有擴增序列的準確性；利用Clustal W對所測序列mtDNA D-loop進行同源序列比對分析，用MEGA 5.0 進行遺傳距離計算及分子系統進化樹的構建。

表1 國內外豬種類型及GenBank登錄號

2 結果

2.1 線粒體DNA D-loop序列

貴州3個地方豬種mtDNA D-loop區序列已上傳至GenBank，ID號為：KF913251-KF913288，序列長度為1 254-1 314 bp之間，序列堿基組成如表2。由表2可知，3個地方豬種的堿基含量A+T都明顯高于G+C的含量，其中A含量高于其他堿基的含量，G堿基的含量最低。D-loop的變異集中在5'端，中間為串聯重復序列，3'端沒有檢測到變異，可把D-loop分為3個區：高變區、串聯重復區和保守區。

表2 貴州3個地方豬種堿基含量

2.2 種間遺傳距離計算和系統進化樹構建

鑒于3個地方豬種mtDNA D-loop區的序列具有高變區變異豐富、串聯重復區內重復片段重復次數不同和保守區無變異的特點，并參照以往對豬mt DNA D-loop區的研究，本研究基于mtDNA D-loop高變區對貴州3個地方豬種與國內外其他豬種進行遺傳距離分析及系統發育樹的構建。

2.2.1 遺傳距離 根據Kimura雙參數方法計算貴州3個地方豬種與其他國內外豬種的種間遺傳距離，結果如表3。由表3可知，國內豬種之間的遺傳距離較小（0.001 4-0.008 7），遠小于其與國外豬種間的遺傳距離（0.175-0.264）。貴州地方豬種之間的遺傳距離在0.002 9-0.007 2之間，白洗豬與黔北黑豬、從江香豬之間的距離最大，均為0.007 2。

2.2.2 系統進化樹 利用Mega5.0軟件將3個地方豬種與在GenBank公布的國內外其他豬種mtDNA D-loop高變區進行比對，分析它們與其他豬種的遺傳分化，結果如圖1。由圖1可知，國內豬種和國外豬種分為兩個不同的類群。國內豬種大致可以分為兩個不同的大類，Ⅰ支和Ⅱ支，Ⅰ支為華南型、西南型和高原型，Ⅱ支為華北型、華中型和江海型。其中，西南型的黔北黑豬和雅南豬歸屬于Ⅱ支；華北型沂蒙黑豬、八眉豬和華中型的寧鄉豬歸屬于Ⅰ。貴州地方豬種白洗豬、糯谷豬、從江香豬和宗地花豬歸屬于Ⅰ支，并分屬于不同的小支。

3 討論

3.1 遺傳關系分析

Yang等［7］、王繼英等［8］對國內外豬種的mt-DNA D-loop區的分析結果表明，中國地方豬種間的遺傳距離較小，而與國外豬種間的遺傳距離較大。本研究發現，中國地方豬種之間的遺傳距離變異為0.001 4-0.008 7，國外豬種之間的遺傳距離變異為0.002 9，而中國地方豬種與國外豬種之間的遺傳距離變異為0.017 5-0.026 4。本研究結果與Yang等、王繼英等的研究結果一致，都發現了中國地方豬種間的親緣關系較近，而與國外豬種的親緣關系較遠。貴州地方豬種之間的遺傳距離在0.002 9-0.007 2之間，白洗豬與黔北黑豬、從江香豬之間的距離最大，均為0.007 2，這個結果顯示了貴州地方豬種豐富的遺傳多樣性。黔北黑豬位于貴州北部，白洗豬則位于貴州東南部，兩豬種之間的遺傳距離與其他貴州地方豬種間相比較大與其地理距離差異相符；白洗豬與從江香豬雖都分布于貴州東南部，其遺傳距離確較貴州其他豬種間大，從傳統形態學來看卻也具有相當大的差異：從江香豬屬于微型地方豬種，體型較白洗豬小得多；從江香豬額部皺紋淺而少，白洗豬則深而多。

圖1 基于mtDNA D-loop高變區構建的豬科28個豬種的NJ系統發育樹

3.2 系統進化分析

目前，關于豬mtDNA D-loop的研究中，豬的起

源進化一直是國內外研究者關注的熱點。劉娣等［9］通過豬的Myostatin基因，從分子水平上說明了家豬是由野豬進化而來。Watanabe等［10］首先研究mtDNA限制性酶切圖譜，發現亞洲豬和歐洲豬具有獨立的起源；Giuffra等［11］分析了mtDNA細胞色素B（cytB）基因的全部編碼序列、D-loop高變區440 bp的序列和3個核基因序列，結果表明家豬起源于歐亞野豬（Sus scrofa），歐洲家豬和亞洲家豬各有其獨立起源：歐洲地區的野豬亞種和亞洲地區的野豬亞種；Kijas等［12］分析了幾乎整個mtDNA基因組序列，與該結果吻合；張冬杰等、Yang等和王繼英等［7，8，13］基于mtDNA D-loop區的研究結果也表明中國豬種與外國豬種具有不同的起源。黃勇富等［14］研究中國24個地方豬種mtDNA限制性酶切長度多態性后，認為中國家豬起源于同一個野豬亞種。但是茍瀟等［15］在研究云南地方豬種起源關系時認為，云南地方豬種的祖先應該是兩個不同的亞洲野豬亞種；李洪濤［16］等在研究藏豬的mtDNA時也得出藏豬有兩個母系起源的結論。劉曉輝等［17］通過對Y染色體DNA序列研究中國家豬起源進化發現，中國至少存在兩個差異顯著的起源中心：北方野豬可能是中國北方家豬品系的祖先，南方野豬則是南方家豬品系的祖先。

表3 28個國內外豬種間的遺傳距離

從本研究所構建的進化樹可知，國內豬種和國外豬種各自聚為一個獨立的支系，為不同的兩個類群，與前人的研究結果一致，也進一步支持了現代家豬有歐亞兩大母系起源的二元論觀點。中國地方豬種傳統上按其體型外貌特征、生產性能和地理分布等因素大致分為華北型、華中型、江海型、華南型、西南型和高原型六種類型。在本研究構建的進化樹中，可將中國地方豬種劃分為Ⅰ支和Ⅱ支，Ⅰ支主要為華南型、西南型和高原型，多數為分布于南方的豬種；Ⅱ支主要為華北型、華中型和江海型，多數為分布于北方的豬種；研究結果支持劉曉輝等北方家豬品系和南方家豬品系有兩個不同起源的的觀點。

由進化樹還可以看出，中國地方豬種與按照分支Ⅰ、Ⅱ來分類不能嚴格的對應，傳統分類方法中屬于同一分型的豬也并不都在同一個小的分支上。本研究所涉及的3個貴州地方豬種中，從江香豬和白洗豬與大多數南方的豬種分布于支系Ⅰ，而黔北黑豬則聚類于北方豬種較多的支系Ⅱ中。黔北黑豬體型較大、全身被毛黑色，與北方豬種分為一類，符合中國地方豬種體型“北大南小”、毛色“北黑南花”的特點。我國在千年來的文明發展史上多有人民的遷徙，家養動物在此過程中隨人們的遷徙而與其他地方的品種雜交有很大的可能性。以上說明地方豬種間存在著廣泛的基因交流的現象，也可能緣于聚類分析法和傳統分類法由于分類依據的不同，分類結果也具有一定的差異性。

4 結論

本研究獲得了貴州地方豬種白洗豬、從江香豬和黔北黑豬的mtDNA D-loop全序列，并基于D-loop區高變區計算國內外豬種之間的遺傳距離及構建系統發育進化樹，結果表明，國內豬種之間的遺傳距離小，而與國外豬種之間的遺傳距離大；國內外豬種分為明顯兩個不同類群，國內豬種大致分為南方、北方兩個類群。

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（責任編輯 李楠）

Phylogenetic Analysis of Three Domestic Pig Breeds in Guizhou Province

Ding Mei1Chen Xiang1，2Xu Houqiang1Wu Tonggui3Feng Wenwu1Bai Lin1
（1.Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025；2.Guizhou Engineering Technology Research Center for Healthy Pig Breeding，Guiyang 550025；3.Shibing Breed Improvement Centre for Livestock and Poultry，Kaili 556200）

PCR product of the complete mitochondrial control regions of 57 pigs from 3 Chinese pig breeds in Guizhou（Baixi pig, Congjiangxiang pig and Qianbeihei pig）were directly sequenced, the genetic distance between the mtDNA of three breeds of pig with other 25 pig breeds was calculated, and the phylogenetic tree was built. The results revealed that, the sequences of the mtDNA D-loop of the three pig breeds were 1 254-1 314 bp, the genetic distance between the three breeds was 0.002 9-0.007 2, comparing Baixi pig with Qianbei Black pig and Congjiang xiang pig, the genetic distance of Baixi pig was great, all of 0.007 2. The results of phylogenetic anslysis supported the view that the Chinese pig breeds respectively originated from the Southern and the Northern, and there were gentic exchanging among the Chinses pig breeds.

mt DNA D-loop Genetic distance Domestic pig breeds Phylogeny

2013-12-20

貴州省動植物育種專項（黔農育專字［2011］019號），貴州省農業公關項目（黔科合NY［2013］3071號），貴州省工程中心建設項目（黔科合農C字［2001］4022號）

丁玫，女，研究生，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種與繁殖；E-mail：ddingtang@yeah.net

陳祥，男，博士，教授，研究方向：動物繁殖與動物生物技術；E-mail：as.xchen@gzu.edu.cn