棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）FK506結合蛋白基因的克隆、表達與純化

劉小寧 李芬 趙文博 朱燕 趙潔

（新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）FK506結合蛋白基因的克隆、表達與純化

劉小寧 李芬 趙文博 朱燕 趙潔

（新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

為了深入了解FK506結合蛋白基因的作用和探索調控棉鈴蟲CYP6B6的表達機制，基于單酵母雜雜交結果采用RT-PCR的方法從棉鈴蟲的中腸cDNA中擴增得到了FK506結合蛋白基因，將測序正確的目的片段克隆至原核表達載體pET32a中，在大腸桿菌BL21中用異丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTG）誘導表達，通過鎳柱離子親和層析純化目的蛋白。用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達和純化結果，并用Western blotting進行驗證。結果表明，克隆得到的目的基因大小為327 bp，編碼108個氨基酸殘基，預測蛋白質分子量和等電點分別是11.78 kD和7.87。氨基酸序列分析表明該序列具有完整的開放閱讀框，且沒有信號肽。重組質粒pET32a-FKBP在大腸桿菌BL21中獲得表達，主要以可溶性形式存在，經親和層析柱純化獲得目的蛋白，Western blotting檢測發現純化的目的蛋白大小正確且純度高。

棉鈴蟲 FK506結合蛋白基因 單酵母雜交

酵母單雜交技術可以通過對報告基因的表型檢測，分析DNA與蛋白之間的相互作用，以研究真核細胞內的基因表達調控機制。因此現階段，該技術常用來尋找與DNA順式作用元件相互作用的特定轉錄因子［1］。前期本課題組構建了含有細胞色素P450CYP6B6基因上應答植物次生物質脅迫的順式作用元件AhR（Aryl hydrocarbon receptor）的酵母報告株（酵母誘餌報告子），通過與植物次生物質2-十三

烷酮脅迫后的六齡棉鈴蟲的cDNA文庫蛋白進行雜交，以期尋找能夠與芳香烴受體AhR相互作用的轉錄因子或調控蛋白。經過一系列的篩選與鑒定，最終捕獲到一些獵物蛋白，其中一個長度為327 bp的序列在NCBI上用Blast軟件比對發現其與多種登錄昆蟲的FK506結合蛋白基因（FK506 binding protein，FKBP）序列同源性很高，為79%-84%，與煙草天蛾（Manduca sexta）及家蠶（Bombyx mori）FKBP的同源性最高，如圖1所示。

將該基因的蛋白序列輸入到PDB數據庫（protein data bank）中尋找與其同源關系較近的蛋白，發現其三級結構與肽基-脯氨酰基-順反異構酶（Peptidylprolyl cis-trans isomerase，PPIases）FKBP1A的同源性最高，達77.8%，圖2-A顯示了該酶的第一模型結構圖，圖2-B紅色鏈給出了FKBP-型肽基-脯氨酰基-順反異構酶的活性中心結構模式圖。因此推測該蛋白應該屬于FKBP-C超家族。

圖1 酵母單雜交捕獲的獵物蛋白在NCBI上比對結果

圖2 肽酰脯氨酰順反異構酶的結構模型

FKBPs是一類能與大環內酯類免疫抑制劑FK506和雷帕霉素特異性結合的高度同源的受體類蛋白家族，在原核生物與真核生物細胞中廣泛存在且含量豐富［2-4］，它們具有PPIases活性，可催化多肽或蛋白質底物中的肽-脯氨酸順反子的轉換，從而影響其活性、磷酸化狀態、蛋白質間相互作用、亞細胞定位及穩定性［5，6］，FKBPs還有許多其它的重要的生理功能，如細胞周期的調節、通道活性的調節以及在發育上的作用等。當FK506與FKBP結合后，FK506特有的立體化學結構就抑制了FKBP的PPIases活性，進而發揮其免疫抑制效應［7-9］。

現已發現FKBP家族成員有20多個，在植物、哺乳動物中發現較多［9，11］，昆蟲中較少，棉鈴蟲中還未見報道，目前FKBP在棉鈴蟲體內的功能和作用，以及該蛋白與CYP6B6基因啟動子的關系尚不明確。因此本研究對捕獲到的FKBP基因進行克隆和原核表達，并對表達的蛋白進行鑒定與純化，為后期的研究提供素材。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試蟲、菌株和載體 棉鈴蟲源自中國農業大學昆蟲毒理室，于室內用人工飼料長期飼養，為未接觸過農藥的敏感品系昆蟲。克隆菌株E. coliDH5α和表達菌株E. coliBL21感受態細胞均購自北京全式金公司；表達載體PET32a為本實驗室保存。

1.1.2 試劑 高保真的Pfu DNA聚合酶購自Promega公司；dNTP、DNA Maker、限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、Oligo d（T）18Primers，Reverse Transcriptase M-MLV（RNase Hˉ），Recombinant Ribonuclease Inhibitor均購自大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、PCR產物回收試劑盒及質粒提取試劑盒、實驗引物合成、DNA序列測定均來自上海生工生物有限公司；總RNA提取試劑RNAiso Plus試劑盒購自Invitrogen公司；蛋白Maker購自Fermentas公司；Ni-NTA Agarose 購自Qiagen公司；一抗鼠抗His-Tag單克隆抗體、二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgA抗體購自中杉金橋公司；ECL顯色試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；其余

所用的化學試劑（無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇等）均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸引物的設計合成 根據酵母單雜交捕獲的獵物蛋白FK506結合蛋白基因的編碼區序列設計合成了RT-PCR 擴增所需的兩個引物，擴增目的片段約為327 bp，下劃線為引入的酶切位點（BamH I和Hind III）序列：上游引物：5'-CGGATCCATGGGAGTTAACGTTGAAAC-3'；下游引物：5'-CAAGCTTTTATTCGAGACGCAGGAGTTC- 3'。

1.2.2 FK506結合蛋白基因的擴增 使用RNAiso Plus試劑提取六齡棉鈴蟲幼蟲的RNA，當制備的RNA較純，無蛋白質污染時，按照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑1st-Strand cDNA 合成的實驗操作方法進行逆轉錄反應獲得棉鈴蟲的cDNA，取其中1 μL作為PCR反應的模板。循環參數為：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，反應35個循環，最后72℃延伸7 min。1%瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物，DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物中的目的片段。

1.2.3 原核表達質粒pET-FKBP的構建 將回收產物和載體pET32a分別用BamH I和Hind III進行雙酶切，純化后16℃過夜連接，連接產物轉化DH5α，篩選陽性重組子，提取質粒進行酶切鑒定，正確的重組質粒命名為pET32a-FKBP，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

應用DNAMAN軟件進行核酸序列、氨基酸序列的相似性以及同源性分析；應用SignalP 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）軟件進行信號肽的預測；應用ExPASy ProtParam（http：//web. expasy.org/protparam/）軟件進行蛋白質分子量、等電點預測；應用ExPASy Protscale（http：//web.expasy. org/protscale/）軟件進行蛋白質疏水性的預測。

1.2.4 融合蛋白pET32a-FKBP的表達、鑒定及純化 將測序結果正確的陽性克隆轉化到BL21感受態細胞中，將菌液PCR鑒定正確的克隆活化至對數期后，加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導物IPTG，37℃振蕩培養4 h。以同時轉化有空載體pET32a的BL21及未誘導的菌液作對照，15%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

通過Western blot檢驗目的蛋白在BL21菌株中的正確表達。用5%脫脂奶粉4℃過夜封閉；TBST沖洗，加入1∶500稀釋的抗His標簽的抗體（一抗），室溫孵育2 h；TBST沖洗后加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體（二抗），室溫孵育1 h。采用ECL化學發光法顯色，LAS-4000成像系統（美國）進行觀察。

將重組菌誘導后超聲破碎至相對透亮（間隔5 s，共30 min），并將上清和沉淀分開處理，用15%的SDS-PAGE檢驗該重組蛋白的可溶性。將處理得到的總蛋白按照Ni-NTA His Tag Kit說明書依次用含不同濃度咪唑（5 mmol/L，5次；30 mmol/L，2次；50 mmol/L，2次；800 mmol/L，1次）進行洗脫，分別收集所有過程的流出液并進行標記。15%的SDSPAGE檢測，與預測大小一致、條帶較粗且單一的樣品所對應的流出液即是所需要純化的目的蛋白。

采用孔徑大小為10 kD的超濾管過濾濃縮（7 000 r/min離心30 min）目的蛋白，于-80℃保存備用。

2 結果

2.1 目的基因的RT-PCR擴增

用設計的特異性引物，以棉鈴蟲的 cDNA為模板進行PCR 擴增，35個循環后，將PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果（圖3）顯示，在327 bp處有一條明顯的特異性擴增帶。

圖3 RT-PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 原核表達質粒pET32a-FKBP的構建與鑒定

目的基因經BamH I和Hind III雙酶切后與表達載體pET32a連接轉化大腸桿菌DH5α，提取重組質粒，再用BamH I和Hind III進行雙酶切鑒定，結果如圖4所示，質粒提取質量較好，酶切后目的基因

線性化，大小正確。

圖4 重組質粒pET32a-FKBP雙酶切鑒定結果

雙酶切鑒定正確的重組質粒，經過生工測序后對序列進行分析，用DNAMAN軟件與酵母單雜交獲得的序列比對，結果一致，說明獲得正確的目的基因，該基因具有完整的開放閱讀框及起始密碼子ATG，其編碼區含324 bp核苷酸，正確編碼108個氨基酸（圖5）；利用SignalP 3.0 Server在線軟件預測出該蛋白在N端沒有信號肽，利用其它生物信息學軟件得知該蛋白的分子量為11.78 kD，等電點為7.87，為親水性蛋白。

圖5 FKBP基因序列和氨基酸序列的信息

2.3 FKBP融合蛋白的誘導表達、鑒定及純化

通過15%的SDS-PAGE檢測顯示（圖6），空載體pET32a及重組pET32a-FKBP質粒轉化到表達菌BL21經IPTG誘導表達后與誘導表達前相比，均有一條明顯的蛋白質增強條帶，表達載體分子量為20 kD左右，FKBP的分子量為11.78 kD，故融合蛋白應為32 kD左右，誘導表達后與與預期的FKBP蛋白相對分子量相似，說明目的蛋白誘導表達成功。

圖6 FKBP 誘導表達結果

對誘導表達正確的融合蛋白做Western blot驗證，用ECL法在NC膜上顯色，結果（圖7）顯示目的條帶單一且清晰，說明目的蛋白表達正確。

超聲破碎后的菌體將上清和沉淀分別處理后經15%的SDS-PAGE檢測顯示，表達的融合蛋白主要存在于上清液中，充分說明該蛋白屬于可溶性蛋白。由于融合蛋白的N端帶有His標簽，所以選用Ni-NTA-agarose親和層析柱進行純化。15%的SDSPAGE檢測顯示，用50 mmol/L咪唑洗脫第二次的目的蛋白條帶單一、清晰而且相對表達量較大，將收集的蛋白液用10 kD的超濾管過濾濃縮，同樣經Western blot驗證，結果（圖7）顯示純化后的蛋白與目的蛋白大小一致，說明表達的融合蛋白被純化為單一條帶。

圖7 Western blotting 檢測融合蛋白及純化后的目的蛋白

3 討論

FKBPs 主要通過它們各自分子量的大小不同而進行區分和命名［12］，該家族基因的數量仍在增長，現已發現的有FKBP12，12.6，13，15，22，23，25，36，38，51，52，55，60，63和65［13］。這些蛋白具有不同特征，不僅在染色體上的定位和氨基

酸序列不同，而且在細胞內的位置和功能也不同［14］。其中12 kD的FKBP12蛋白是該家族的代表性成員，它的結構已經通過X-射線和核磁共振技術（Nuclear magnetic resonance，NMR）得到［4］。目前為止人們在哺乳動物中發現FKBP12的兩種亞型，分別命名為FKBP12和FKBP12.6，這兩個FKBP12都由108個氨基酸殘基組成，含有PPIase結合域，分子量分別為11.95 kD和11.78 kD［15］。

本試驗利用RT-PCR法擴增得到的棉鈴蟲FKBP基因開放閱讀框長 327 bp，編碼108個氨基酸，蛋白大小為11.78 kD，等電點為7.87，經BLAST比對，具有FKBP家族特有的結構域且與其他物種尤其是昆蟲的FKBP有很高的同源性，如煙草天蛾、家蠶等。所以作者認為得到的確實為棉鈴蟲的FKBP序列，且為FKBP12的一種亞型。

為了進一步了解該蛋白的特性，將克隆得到的目的基因與高效表達載體pET32a進行連接，構建了pET32a-FKBP重組表達質粒，將重組質粒轉化到感受態細胞BL21中，用IPTG誘導表達融合蛋白。由于pET32a上帶有6個His標簽，它是最常用的純化蛋白的融合標簽，具有相對分子質量小、不影響目的蛋白的功能、免疫原性相對較低、純化操作簡單、成本低等優點［16，17］。因此，我們利用親和層析法成功純化了目的蛋白FKBP，摸索出一套改進的構建FKBP蛋白的原核表達體系，獲得大量FKBP蛋白。

已有報道表明FKBP12蛋白與信號轉導密切相關，參與了新陳代謝，細胞周期，細胞生長發育、細胞存活和凋亡以及基因轉錄等多種細胞生命活動［18-20］，本試驗克隆、表達并純化得到了棉鈴蟲的FKBP蛋白，這將有助于我們更好地闡明棉鈴蟲的生長發育過程，同時更好地了解細胞色素P450CYP6B6與FKBP相互協調作用的具體機制及兩者在細胞生命活動中的作用機理。

4 結論

本研究在前期單酵母雜交工作的基礎上，克隆得到棉鈴蟲FK506結合蛋白基因，成功在大腸桿菌中進行表達并用親和層析法純化了目的蛋白FKBP，繼而用Western blotting驗證獲得的目的基因，為后續的研究奠定良好的基礎。

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（責任編輯 李楠）

Cloning，Expression and Purification of FK506 Binding Protein Gene from Helicoverpa armigera

Liu Xiaoning Li Fen Zhao Wenbo Zhu Yan Zhao Jie
（College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，Urumqi 830046）

In order to better understand the role of FK506-binding protein gene and its regulatory mechanism in the CYP6B6 expression of Helicoverpa armigera, the FK506-binding protein cDNA sequence from midgut of H. armigera by RT-PCR was cloned on the basis of result of yeast one-hybrid. The fragment digested by double enzymes was linked to a prokaryotic expression vector pET32a to construct the recombinant expression plasmid pET32a-FK506BP, and then converted into competent Escherichia coli BL21 cells. The fusion protein was induced to express by isopropyl-3-D-thiogalactoside（IPTG）, and purified by immobilized metal-chelating affinity chromatography（IMAC）using a Ni2+matrix column. SDS-polyaerylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）and Western blotting analysis were used to examine the fusion protein. The results of sequencing and sequence analysis showed that the open reading frame of the FK506 binding protein gene was 327 bp, encoding 108 amino acid residues with the predicted molecular weight and isoelectric point of 11.78 kD and 7.87, respectively. The predicted protein had no signal peptide. The recombinant containing recombinant pET32a-FK506BP expressed a soluble protein after being induced by IPTG. SDS-PAGE and Western blot analysis indicated that the fusion protein, purified using Ni2+affinity chromatography, had the predicted size and higher purity.

Helicoverpa armigera FK506-binding protein Yeast one-hybrid

2013-11-07

國家自然科學基金項目（31260444），農業部行業項目（200903033）

劉小寧，女，博士，研究方向：農業昆蟲與害蟲防治；E-mail：liuxn0103@sina.com；李芬同為本文第一作者