一株耐鹽弧菌Vibrio sp.K1-L的分離與鑒定

王菲 劉抗 范家同 成守亮 王子元

（江蘇師范大學 生命科學學院，徐州 221116）

一株耐鹽弧菌Vibrio sp.K1-L的分離與鑒定

王菲 劉抗 范家同 成守亮 王子元

（江蘇師范大學 生命科學學院，徐州 221116）

從山西運城鹽湖水樣中分離出一株細菌K1-L，能在2%-10%的MGM固體培養基上出現群游現象。該菌株為革蘭氏陰性菌，周生鞭毛，電鏡下大小約為0.4 μm×（1-2）μm，其菌落形態為圓形，灰色。菌株K1-L的最適生長鹽濃度、溫度和pH值的范圍分別為2%-6%、30-40℃和6.0-7.0，GC含量為47.06%。通過對其形態學、生理生化試驗，16S rRNA基因序列及系統發育學的分析，發現其與Vibrio diabolicus HE800T和Vibrio rotiferianus LMG 21460T等細菌的16S rRNA有高度同源性，最大的相似性均為99%，確定該菌株K1-L為弧菌屬（Vibrio）。

運城鹽湖 弧菌屬 耐鹽菌 系統發育分析

耐鹽菌對環境具有一定的適應能力，在一定鹽度范圍內微生物通過自身的滲透調節機制用以平衡細胞內的滲透壓或保護細胞內的原生質，進而調節自身的新陳代謝以適應鹽度的變化［1，2］。

近年來，有關耐鹽及嗜鹽菌用于處理高鹽廢水的研究報道較多，美國NotreDame大學的研究人員利用從美國大鹽湖中分離出的菌種處理鹽度為1%-15%的含酚廢水，酚的去除率達到99%，該試驗中分離得到的菌種在含鹽氨氮磷與鐵的環境中就可生長［3］。耐鹽及嗜鹽菌處理高鹽廢水在廢水處理工藝上得到較多的應用。Kargi 等［4］在轉動式生物轉盤中投入嗜鹽菌處理含鹽廢水，含鹽量5%時的COD去除率為85%。Woolard等［5］利用中度嗜鹽菌處理含鹽量15%的廢水，對苯酚的去除率高達99.5%。本研究通過分析從山西運城鹽湖水樣中分離的菌株K1-L的16S rRNA基因序列，建立菌株K1-L的系統發育進化樹，并對其生理生化特性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 菌株K1-L分離自山西運城鹽湖水。

1.1.2 試劑 DNA Marker、限制性內切酶等購于Fermentas；引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.1.3 儀器 恒溫培養箱、恒溫搖床、UV-7504紫

外可見分光光度計、顯微鏡（Olympus）、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀和日立掃描電鏡。

1.1.4 培養基 5% MGM（Modified growth medium）培養基：30%人工海水166.7 mL/L（配制參照Mike、Dyall-smith所報道的方法［6］），胰蛋白胨5 g/L，酵母膏1 g/L，去離子水定容至1 L，調節pH至7.5。配制固體培養基時加1.5%的瓊脂。其它鹽濃度的MGM培養基采用同樣的方法配制。

1.2 方法

其基本原理之二：概念與案例構成的多維與非線性的“十字交叉”形狀（“criss-crissing”of conceptual and case landscape）。此原理強調了真實情景對于知識掌握的重要性，“要多樣化的應用知識，就必須展現知識的多重聯系和知識對情景脈絡的依賴性”（李明振等，2007）

1.2.1 菌株的分離方法 從山西運城鹽湖取水樣涂布于10% MGM培養基，由于出現向邊緣擴散生長的現象（即細菌群游現象），不能形成單菌落，故將其接種到LB固體培養基上，37℃過夜培養，能長出單菌落，連續劃線純化菌株。

1.2.2 形態學特征 將菌株K1-L在LB固體培養基上劃線培養，獲得單菌落，觀察其菌落形態，并進行革蘭氏染色及鞭毛染色［7］，掃描電鏡觀察。

1.2.3 生理生化指標的測定

1.2.3.1 生化和酶學鑒定 參考東秀珠等［8］的著作《常見細菌系統鑒定手冊》，測定菌株利用糖類、氨基酸的生理特征及MR（Methyl red）和VP（Vogesproskauer）等生化特性，以及接觸酶等酶學特征。

1.2.3.2 抗生素敏感試驗［9］參照美國國家臨床實驗室標準委員會（NCCLS）紙片擴散法敏感試驗分委會推薦的K-B法（即紙片擴散法），以大腸桿菌ATCC 25922作為參照菌株，進行3次平行試驗。

1.2.3.3 鹽濃度對菌株生長的影響 將菌株K1-L等量的菌懸液分別接種于鹽濃度為0%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、10%、12%、15%、20%的50 mL無菌MGM液體培養基中，于37℃條件下搖床培養，在培養8 h后測定菌懸液的吸光度OD600值（測量時調節菌液濃度：0.1＜OD600＜0.4），進行3次平行試驗。以鹽濃度為橫坐標，OD值（測定的OD值乘以稀釋倍數）為縱坐標繪制曲線［10-12］（數據經SPSS 17.0軟件處理和Excel 2003作圖）。

1.2.3.4 溫度對菌株生長的影響 將菌株K1-L等量的菌懸液接種于3%MGM液體培養基中，分別于22℃、25℃、30℃、34℃、37℃、40℃條件下培養8 h，測定各溫度下菌株K1-L的OD600值，進行3次平行試驗。以培養溫度為橫坐標，OD值（測定的OD值乘以稀釋倍數）為縱坐標繪制曲線。

1.2.4 菌株16S rRNA基因序列分析 依據總基因組DNA的提取方法［6］獲得基因組DNA，利用通用引物對16S rRNA 基因進行擴增，引物序列為：27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CTA CGG TTA CCT TGT TAC GAC-3'）。PCR反應體系：10xPCR緩沖液5 μL，上下游引物各2 μL，dNTPs（5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）5 μL，TaqDNA 聚合酶（5 u/μL）0.5 μL，DNA模板2 μL，加水至50 μL。所用擴增程序：95℃，5 min；95℃ 45 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，35個循環；72℃ 10 min。擴增產物經TA克隆，送上海生工生物技術有限公司測序。將菌株的16S rRNA基因序列提交到NCBI和EzTaxon server 2.1數據庫上，獲得與該菌序列同源性高的相關菌株16S rRNA基因序列。再用CLUSAL X 1.83軟件［13］進行序列比對。在MEGA version 3.1軟件［14］中用Neighbour-joining法［15］構建系統發育進化樹。

2 結果

2.1 篩選結果

分離出的細菌命名為K1-L，該菌在2%-10% MGM固體培養基上有群游現象（圖1），菌株在5%MGM培養基上培養11 h群游59 mm。

圖1 菌株K1-L的群游能力

2.2 鑒定結果

2.2.1 形態觀察和生理生化特性 菌株K1-L在LB培養基上培養12 h后形成灰色、圓形、半透明菌落，邊緣整齊，表面光滑。革蘭氏染色為陰性，鞭毛染色可見其鞭毛著生方式為周生（圖2），電鏡下菌株K1-L呈短桿和弧狀，大小為0.4 μm×（1-2）μm（圖3）。生理生化結果見表1。

表1 菌株K1-L的生理生化特征

圖2 菌株K1-L的鞭毛染色

圖3 菌株K1-L的掃描電鏡照片

2.2.2 16S rRNA序列分析與構建系統進化樹 測序獲得菌株K1-L的16S rRNA 基因序列，獲得大小為1 498 bp的序列，GenBank登錄號為：JF930162。菌株K1-L的16S rRNA序列與弧菌屬Vibrio diabolicusHE800T和Vibrio rotiferianusLMG 21460T等細菌的16S rRNA最大相似性均為99%，并與同源性高的相關菌株構建系統發育樹（圖4）。

圖4 菌株K1-L的系統發育樹

2.2.3 鹽濃度對細菌生長的影響 由圖5可以看出K1-L在1%-15%鹽濃度下均可生長。菌株K1-L的生長最適鹽濃度范圍是2%-6%，可耐受鹽濃度的范圍較廣。

圖5 鹽濃度對菌株K1-L生長的影響

2.2.4 溫度對細菌生長的影響 由圖6可以看出，K1-L在22-40℃的溫度范圍內均能生長，最適生長溫度范圍是30-40℃。

圖6 溫度對菌株K1-L生長的影響

2.2.5 培養基pH值對細菌生長的影響 由圖7可以看出，K1-L對環境中的pH有較強的耐受能力，尤其耐堿，在pH5.0-10.0的范圍內都能生長。K1-L最適生長pH范圍是6.0-7.0。

圖7 培養基pH值對菌株K1-L生長的影響

3 討論

Drancourt［16］認為16S rRNA基因序列相似性≥99%的菌株為同一個種。通過對菌株K1-L的16S rRNA基因序列同源性比對發現，該菌株與弧菌屬（Vibrio）的VibriodiabolicusHE800T、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌等的序列相似性均為99%，確定其為弧菌屬。弧菌屬細菌分布廣泛，是普通的水生菌，海水和淡水中最為常見，人及動物的消化道中也有。從構建的進化樹上看，菌株K1-L與VibriodiabolicusHE800T和VibrioEx25的聚在一支上，VibriodiabolicusHE800T和VibrioEx25生長在極端環境中，該地區有豐富的金屬，而有些金屬正好是這些反應所需酶的穩定劑或催化劑［17］。而菌株K1-L取自山西運城鹽湖，該湖是一個常溫、常壓和鹽含量高的環境，可見，它們的生存環境具有較大差異。

菌種的形態特征是由遺傳物質和生存環境等因素共同決定的，利用基于形態學、生理生化及分子生物學等技術的多相分類鑒定方法現已廣泛應用于微生物分類學研究領域［18］。對其生理生化指標進行試驗后發現，K1-L與VibriorotiferianusLMG21460T、VibriodiabolicusHE800T等的氧化酶陽性和對O/129（150 μg）敏感是它們共有的特性。對其生長的條件的比對發現，副溶血性弧菌［16］和溶藻弧菌［16，17］、VibriorotiferianusLMG21460T［19］、VibriodiabolicusHE800T鹽濃度生長范圍較窄，而菌株K1-L生長范圍較廣，且在15%的鹽濃度下還能生長，有較高的耐鹽性，原因可能是鹽湖夏季水分蒸發導致湖水鹽濃度提高，菌株K1-L經過長期的進化適應了這種環境。

已知VibriodiabolicusHE800T（表2）生長在極端環境中，該地區有豐富的金屬，而有些金屬正好是這些反應所需酶的穩定劑或催化劑。Vibriodiabolicus-HE800T的胞外分泌物表多糖（EPS）具有固著和吸附的作用，這種作用正好可以吸附重金屬使其自身免受傷害［19］。由此可見，可能是由于長期的環境作用導致VibriodiabolicusHE800T和實驗室所分離K1-L向不同方向的進化，且菌株K1-L可在較高鹽濃度下存活，根據信欣報道［20］，傳統生物法無法去除含高濃度有機污染物的廢水，而耐鹽菌可以降解高濃度

有機廢水，取得了良好的效果。

表2 菌株K1-L與Vibrio diabolicus HE800T［5］特征比較

4 結論

本研究針對自山西運城鹽湖水中分離得到的細菌K1-L 進行多相分類學鑒定，并最終確定為弧菌屬，且此菌具有一定的生理生化特征及酶學活性，且可在較高鹽濃度下存活，在高濃度污水處理方面也有較好的應用前景及實踐意義。

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（責任編輯 李楠）

Isolation and Identification of a Halotolerant—Vibrio sp. K1-L

Wang Fei Liu Kang Fan Jiatong Cheng Shouliang Wang Ziyuan
（School of Life Science，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116）

Strain K1-L, isolated from Yuncheng Salt Lake, Shanxi Province, could swim on the 2%-10% MGM medium. The strain K1-L was Gram-negative with polar flagellum and was 0.4 μm ×（1-2）μm under the scanning electron microscope. Strain K1-L appeared grey, rounded colony. Its optimum salt concentration, temperature and pH ranges were 2%-6%, 30-40℃ and 6.0-8.0. The GC content is 47.06%. After comparing the traditional characteristics of morphology, physiological biochemistry and 16S rRNA sequence analysis, we discovered that the strain K1-L was highly homologous to the Vibrio diabolicus HE800Tand Vibrio rotiferianus LMG 21460T. The maximum similarity was 99%. It was asserted that K1-L was belonged to the genus Vibrio, we proposed the name Vibrio sp. K1-L for this strain.

Yuncheng salt lake Vibrio Halotolerant Phylogenetic analysis

2013-10-30

國家自然科學基金項目（30571071），江蘇師范大學王子元教授科研啟動基金（KY2009101），江蘇高校優勢學科建設工程項目，江蘇省教育廳優秀創新團隊項目

王菲，女，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：xzwangfei@126.com

王子元，男，教授，研究方向：極端環境微生物；E-mail：zwang2229@aliyun.com.cn