短小芽孢桿菌脂肪酶基因的克隆、表達及酶學性質研究

蘇二正吳向萍高蓓魏東芝

（1. 南京林業大學輕工科學與工程學院 酶與發酵工程實驗室，南京 210037；2. 華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室魯華生物技術研究所，上海 200237）

短小芽孢桿菌脂肪酶基因的克隆、表達及酶學性質研究

蘇二正1吳向萍2高蓓2魏東芝2

（1. 南京林業大學輕工科學與工程學院 酶與發酵工程實驗室，南京 210037；2. 華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室魯華生物技術研究所，上海 200237）

從土壤樣品中通過篩菌過程獲得一株產脂肪酶的菌株，經16S rRNA 鑒定屬于短小芽孢桿菌，根據已報道的來源于芽孢桿菌的脂肪酶基因設計引物，克隆獲得其全長基因，命名為lipS6，大小為648 bp，編碼215個氨基酸，經比對其與已報道的脂肪酶基因B26 有96%的同源性。構建重組表達質粒pET32a-lipS6，在大腸桿菌中實現了可溶表達，酶活達到2 000 U/mL。重組脂肪酶LipS6的最適溫度為30℃，最適pH為9，低濃度的Ca2+與Mn2+對其有很明顯的激活作用，疏水性有機溶劑對其毒害作用小，在正己烷體系中可以催化酯化反應，最適酯化底物酸為十四酸，底物醇為正丁醇。

脂肪酶 短小芽孢桿菌 基因克隆 重組表達 性質

脂肪酶（EC 3.1.1.3，Lipase），全稱為三酰基甘油酯水解酶（triacylglycerol acylhydrolase），是指能夠分解或者合成甘油三酸酯酯鍵的酶［1］。脂肪酶是科學研究中被關注的最早的酶類之一，已經有100多年的研究歷史［2］。脂肪酶廣泛存在于動物、植物及微生物中，在動物體中脂肪酶控制著消化、吸收及脂肪重建等過程，在植物體中脂肪酶存在于能量儲藏組織中，而微生物如細菌、酵母、霉菌、放線菌等則可產生大量的不同性能的脂肪酶。

微生物脂肪酶具有耐有機溶劑、異構體選擇性、底物專一性、高度位置選擇性和高催化活性的特點［3］，可用于催化酯化、酯交換、醇解、胺解、酰

化等反應。因此，對微生物來源脂肪酶的研究得到了各國科研人員的廣泛關注，極大地帶動了脂肪酶在諸多工業領域的應用。

近年來，微生物脂肪酶的分子生物學研究進展非常迅速，由NCBI 檢索結果知，自1985年Gotz等［4］報道的來源于Staphylococcus的脂肪酶基因至今，已有20 000多條脂肪酶基因被克隆并提交GenBank等公共數據庫。來源不同的脂肪酶基因大小不同，同源程度不同，性質相差很大。芽孢桿菌來源的脂肪酶目前已有很多被克隆［5-7］，通過分析芽孢桿菌屬脂肪酶的一級結構發現，其氨基酸序列中存在“Ala-X1-Ser-X2-Gly”保守五肽，而其它屬脂肪酶含有的是“Gly-X1-Ser-X2-Gly”的保守五肽，第一個Gly被突變為Ala后，酶的活性并沒有被改變，這一現象說明第一個氨基酸起到增加保守五肽的柔韌性以及減少其空間位阻的作用，以便于底物與酶的催化中心之間能夠更好地結合而進行催化作用［8］。此外這類脂肪酶活性中心沒有“lid”覆蓋，底物可以很容易地進出活性中心，因而酶的催化活性較高。

本研究從土壤樣品中篩選獲得一株產脂肪酶的短小芽孢桿菌菌株，并對其脂肪酶基因進行克隆，在大腸桿菌中實現重組表達，研究其基本酶學性質和催化性能，旨在為其進一步應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 取自上海奉賢農村菜地、生活用水廢水溝，上海徐匯飯店廢水、垃圾桶和火鍋店，云南昆明高新區食品廠、飲料廠，內蒙古烏蘭察布大草原蒙古包生活廢渣、煤堆、馬糞堆。

1.1.2 培養基 富集培養基（W/W，%）：酪蛋白胨0.6，大豆蛋白胨0.2，NaCl 0.2，pH自然。

平板篩選培養基（W/W，%）：胰蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，NaCl 1.0，瓊脂1.2，橄欖油乳化液1.0，0.01 g/mL的羅丹明B 0.1。搖瓶發酵培養基（W/W，%）：胰蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，NaCl 1.0，橄欖油乳化液1.0。LB培養基（W/W，%）：胰蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，NaCl 1.0，pH7.0。

1.1.3 菌株、質粒、酶及其它試劑藥品E. coliDH5α感受態菌株、E. coliBL21（DE3）感受態菌株購于天根生物有限公司。pMD19-T載體購于TaKaRa公司，pET32a質粒由本實驗室保存。Premix Taq DNA 聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA 連接酶購自Fermentas 公司。蛋白胨、酵母提取物購自Oxoid 公司。其它試劑藥品均為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 產脂肪酶菌株的篩選 稱取各土壤樣品1.0 g加入含30 mL富集培養基的250 mL三角瓶中于37℃、180 r/min，振蕩培養1 d，將培養物搖勻，取1.0 mL轉接到新的含有30 mL富集培養基的250 mL三角瓶中，同樣條件富集3次。吸取0.1 mL富集后的培養液稀釋后涂布于平板篩選培養基上，倒置培養1-2 d后挑取有較大紅色水解圈的菌落劃線接種于平板篩選培養基上，初步篩選獲得產脂肪酶的單菌落。

將獲得的單菌落接種于搖瓶發酵培養基中培養2 d，吸取發酵液1.0 mL，點入打孔的含羅丹明B的平板篩選培養基中，于37℃恒溫培養，觀察孔周圍的顏色變化，取變色圈較大的對應菌株作菌種鑒定。

1.2.2 菌種鑒定 取2.0 mL過夜培養的菌液，4℃離心收集菌體，按文獻［9］方法提取菌種基因組DNA作為模板，按照文獻［10］進行16S rDNA 序列PCR擴增，上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3'；下游引物：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個循環；于72℃延伸8 min，將產物放置4℃保存。對PCR產物進行電泳驗證，并將含有目的片段的樣品送生工測序，將測序結果在NCBI上進行比對。

1.2.3 脂肪酶酶活測定 以乳化橄欖油作為底物采用堿滴定法測定脂肪酶酶活［11］。0.5 mL待測酶液加入2.0 mL 100 mmol/L pH7.0的磷酸鈉緩沖液中，于水浴搖床上37℃保溫5 min，加入于37℃預保溫的乳化橄欖油底物2.5 mL于180 r/min下反應10 min，用10 mL無水乙醇終止反應。對照中先加10 mL無水乙醇滅活再加底物。在上述條件下，每分鐘水解橄欖油產生1.0 μmol 游離脂肪酸所需的脂肪酶量定義為一個脂肪酶活力單位（U）。

1.2.4 短小芽孢桿菌脂肪酶基因的克隆 根據已經報道的來源于芽孢桿菌屬的脂肪酶基因的保守序列

設計引物：正向引物S6-F1 5'-AATCCGGTTTGTGATGGTCCA-3'和反向引物S6-R1 5'-GTTGACGACGATGAGATCCGCT-3'，以短小芽孢桿菌菌株S6的基因組DNA作模板，PCR擴增保守序列片段，具體過程：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃延伸8 min，于4℃下保存。將PCR產物電泳驗證并割膠回收，將回收的片段與pMD19-T載體連接，轉化入E. coliDH5α的感受態細胞，挑取陽性克隆進行測序。將測序結果在NCBI上進行比對，根據比對結果，設計全長基因序列引物：正向引物S6-F2 5'-CGGGATCCATGAAAGTGATTCGATTTA-3'（下劃線為BamH I酶切位點），反向引物S6-R2 5'-CCGGAAGCTTAATTCGTATTCTGTCC-3'（下劃線為Hind III酶切位點），PCR擴增出lipS6全長基因序列，條件為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，61℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃延伸8 min，于4℃下保存。將PCR產物電泳驗證并割膠回收，獲得的DNA片段與pMD19-T載體連接，將連接后的產物轉化入E. coliDH5α的感受態細胞中，PCR驗證后挑取陽性克隆菌試管培養，將培養的菌液送至華大基因測序，提取陽性克隆菌液質粒，命名為T-S6。

1.2.5 重組質粒的構建與表達 用BamH I和Hind III對T-S6和pET32a進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段和空載體雙酶切后的片段，將回收的目的片段和載體片段用T4 DNA連接酶連接，轉化入E. coliDH5α感受態細胞，挑選陽性菌落提取質粒，將驗證正確的重組質粒命名為pET32a-lipS6。

將重組質粒pET32a-lipS6轉化E. coliBL21中，挑取單菌落接種于含有100 mg/L Ampicilin的50 mL LB液體培養基，37℃培養至OD≈0.8，加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，20℃下誘導培養10 h。低溫離心收集菌體，將菌體重新懸浮在含15 mL預冷的20 mmol/L pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，超聲破碎，工作條件為功率200 W，工作4 s，間歇5 s，超聲破碎20 min，將破碎完的菌體裂解液在4℃下10 000 r/min離心10 min，沉淀用相同體積的緩沖液溶解，取全菌體、上清、沉淀進行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.2.6 短小芽孢桿菌脂肪酶基本酶學性質研究 最適溫度測定：按照1.2.3方法，分別于20、25、30、 35、40和50℃下測定脂肪酶的活力。

熱穩定性測定：將脂肪酶液分別放置在30、40、50、60℃的水浴中保溫，分別在15、30、45及60 min時取樣測定酶活。

最適pH測定：配制pH為6.0、7.0、8.0的磷酸鹽緩沖液，pH為8.0、9.0、10.0、11.0的硼砂緩沖液，然后按1.2.3方法在不同pH測定脂肪酶活力。

pH穩定性測定：將脂肪酶液分別加入不同pH值的緩沖液中在4℃中放置3 h，然后將酶液的pH調回到測酶活pH測定酶活。

金屬離子、表面活性劑及抑制劑的影響：向測酶活體系中添加各種金屬離子使其終濃度分別為1和8 mmol/L，添加各種表面活性劑使其終濃度為1 mmol/L，添加EDTA使其終濃度為5 mmol/L，再按照1.2.3的方法測定酶活。

有機溶劑的影響：將75 μL酶液與25 μL有機溶劑混合，用封口膜密封，在30℃搖床中放置3 h后測定殘余酶活。所用有機溶劑為甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、苯、DMSO、正己烷及氯仿。

1.2.7 短小芽孢桿菌脂肪酶酯化性質研究 酯化反應最適脂肪酸的測定：用脂肪酶凍干粉催化丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸與正己醇反應，反應體系為：1 mmol酸+1 mmol正己醇+5 mL正己烷+酶的凍干粉，在30℃搖床中150 r/min下反應8 h，取1 mL反應液8 000 r/min離心1 min，取上清進行氣相檢測。

酯化反應最適底物醇的測定：將丁醇、己醇、辛醇、癸醇、十二醇與十四酸反應，反應體系為：1 mmol醇+1 mmol十四酸+5 mL正己烷+酶的凍干粉，在30℃搖床中150 r/min反應8 h，取1 mL反應液8 000 r/min離心1 min，取上清進行氣相檢測。

氣相條件：HP-5毛細管柱（30.0 m×320 μm× 0.25 μm），氣化室溫度 260℃，檢測室溫度280℃，柱溫120℃保持1 min，然后以10℃/min升到280℃，最后再保持2 min，載氣為氮氣，流速為1.2 mL/min，進樣量為1 μL。

2 結果

2.1 產脂肪酶菌株的篩選和菌種鑒定

經過開始的富集培養，平板的初篩以及復篩，

最后搖瓶發酵產酶驗證等過程，最終從內蒙古烏蘭察布大草原蒙古包生活廢渣中篩選獲得一株產較高脂肪酶活性的菌株，命名為S6。對S6菌株進行16S rDNA 鑒定，所得16S rDNA基因序列長度大約為1 500 bp，將此序列在GenBank 核酸數據庫中進行比對，結果與短小芽孢桿菌的同源性為99%，構建系統進化樹，如圖1所示。

圖1 S6菌16S rDNA克隆文庫細菌進化樹

2.2 脂肪酶基因的克隆與序列分析

根據保守序列引物進行PCR，獲得一段保守序列，測序比對發現，獲得的基因片段與已報道的也是來源于短小芽孢桿菌的脂肪酶基因lipB26有98%的同源性。根據lipB26基因序列設計全長基因引物lipS6-F2和lipS6-R2，梯度PCR后，將得到的基因片段連入T載體進行測序。由測序結果可知，所得到的基因大小為648 bp，編碼215個氨基酸，在NCBI上進行比對，結果顯示，獲得的基因序列與已報道的lipB26的全長基因有96%的同源性，23個堿基不同，氨基酸序列有3個不同，在第30個左右由Ile→Met，Ala→Lys，Glu→Ala。將此脂肪酶基因命名為lipS6，提交GenBank，序列號為JN594059。

2.3 重組表達載體的構建及蛋白表達

將構建成功的重組表達質粒pET32a-lipS6轉入E. coliBL21中進行誘導表達，SDS-PAGE電泳分析結果（圖2）顯示，在35 kD左右有一個明顯的條帶，由于pET32a質粒帶有Trx-tag融合標簽，所以目的蛋白比實際要大。pET32a-lipS6在大腸桿菌中實現可溶性表達（圖2，Lane 2）。收集菌體超聲破碎，離心取上清進行酶活測定，活力達到2 000 U/mL。

圖2 重組質粒pET32a-lipS6在大腸桿菌中的表達

2.4 脂肪酶LipS6的酶學性質

2.4.1 最適溫度和熱穩定性 圖3-A顯示，脂肪酶LipS6的最適溫度為30℃，酶活以最適溫度為中心，呈上升或下降趨勢，在20℃時有70%以上的相對酶活，在60℃時有60%左右的相對酶活。熱穩定性測定表明該脂肪酶穩定性較差，60℃處理1 h后，殘余酶活小于5%，該酶在30℃的穩定性較好（圖3-B）。

2.4.2 最適pH和pH穩定性 圖4-A顯示，脂肪酶LipS6的最適pH為9，為一堿性脂肪酶，在pH8-10之間均具有較高的相對酶活，pH為6或11時，酶活急劇下降。pH穩定性試驗表明該酶的pH穩定性范圍較寬，在pH7-11的緩沖液中存放3 h殘余酶活仍保持80%以上，說明耐堿性能優越（圖4-B）。

2.4.3 金屬離子、表面活性等的影響 不同化學試劑對脂肪酶LipS6酶活的影響見表1。低濃度（1 mmol/L）的Ca2+與Mn2+對脂肪酶LipS6有很明顯的激活作用，酶活提高1.5倍左右。高濃度（8 mmol/L）Mn2對LipS6有輕微的抑制作用。Fe2+、Ag+、Cu2+及Mg2+對LipS6有較明顯的抑制作用。SDS、Tween80及Triton X-100三種表面活性劑對LipS6也有較明顯的抑制作用。EDTA對LipS6有輕微的抑制作用。

2.4.4 有機溶劑的影響 表2顯示，有機溶劑的影響隨著其極性的變化而變化。高極性的有機溶劑如甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等對LipS6的毒害作用大，殘余酶活低。疏水性有機溶劑如正己烷對LipS6的酶活幾乎沒有影響。中等極性的有機溶劑如氯仿、苯的影響介于高極性有機溶劑與疏水有機溶劑之間。DMSO作為一個高極性的有機溶劑其對LipS6的毒害作用并不像丙酮、乙腈那樣明顯。

2.5 非水相中脂肪酶LipS6催化酯化反應特性

由于脂肪酶LipS6在正己烷溶劑中的穩定性很高，因此進一步考察了LipS6在正己烷中催化合

成反應的能力和特性。結果（圖5）顯示，脂肪酶LipS6催化酯化反應的最適底物脂肪酸為十四酸，從正丁酸到十四酸隨著脂肪酸碳鏈增長，脂肪酸的酯化轉化率增加，從十四酸到十八酸隨著脂肪酸碳鏈的增長，脂肪酸的酯化轉化率下降（圖5-A）。脂肪酶LipS6催化酯化反應對短鏈脂肪醇轉化率高，隨著碳鏈的增長，酯化轉化率下降（圖5-B）。

圖 3 溫度對脂肪酶LipS6活力的影響最適溫度（A）及熱穩定性（B）

圖4 pH對脂肪酶LipS6活力的影響最適pH（A）及pH穩定性（B）

3 討論

脂肪酶生物催化的優點有很多，能夠在常溫常壓的條件下進行反應因而所需的條件比較溫和，催化的效率高、特異性強并且不易產生副產物，用化學催化方法易產生有害物質的缺點能夠避免，此外，反應不需要輔酶，反應體系簡單，便于產物的提取以及精制，可以提高產品的質量，使脂肪酶在工業上的應用越來越廣泛［12］。

芽孢桿菌脂肪酶屬于subfamillyI.4，該類脂

肪酶與subfamillyI.5或其它亞族脂肪酶的同源性很低（＜15%），具有分子量小、堿性偏好性、催化功能多等特點。目前為止，研究較多的芽孢桿菌脂肪酶主要來源于Bacillus subtilis、Bacillus stearothermophilus、Bacillus thermocatenulatus、Bacillus thermoleovorans［13］。國內外對短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）脂肪酶的研究報道較少。國外Kim等［13］最早于2002年篩選獲得了一株短小芽孢桿菌B26，該菌產Ca2+不依賴脂肪酶。國內黃瑛等［14］最早于2008年對短小芽孢桿菌脂肪酶進行了克隆和易錯PCR改造。2009年以來，Kumar等［15］、Ismael等［16］、Zhang等［17］、張搏等［18］及李俊峰等［19］進行了產脂肪酶短小芽孢桿菌菌株的篩選、原始菌株發酵產酶條件的優化、克隆表達及部分酶學性質的研究，使短小芽孢桿菌脂肪酶日益受到關注。由前人的研究結果來看，同樣來源于短小芽孢桿菌的脂肪酶的分子性質、酶學性質也存在著差異。因此，本研究同樣進行了產酶菌株的篩選、克隆表達及酶學性質研究，進一步豐富短小芽孢桿菌源脂肪酶的種類，奠定其應用基礎。

表1 不同的化學試劑對脂肪酶活力的影響

表2 有機溶劑對脂肪酶活力的影響

圖5 脂肪酶LipS6在正己烷中催化酯化反應的底物特異性最適酸（A）及最適醇（B）

本研究從環境樣本中篩選獲得一株產脂肪酶短小芽孢桿菌S6，通過芽孢桿菌脂肪酶保守序列設計引物PCR擴增獲得S6菌脂肪酶的保守序列片段，進一步根據B26菌脂肪酶序列設計引物PCR獲得S6菌脂肪酶全長序列，基因大小為648 bp，編碼215個氨基酸，該脂肪酶基因與Zhang等［17］報道的短小芽孢桿菌B106脂肪酶基因大小一致，基因序列同源性為88%，氨基酸序列同源性為95%，比張搏等［18］報道的同樣來源于短小芽孢桿菌HZbp脂肪酶基因大。由于短小芽孢桿菌脂肪酶分子量小，在大腸桿菌中表達時易形成包涵體，為了減少包涵體量，提高可溶性表達，本研究選用質粒pET32a進行異源表達，該質粒具有Trx融合蛋白，能夠幫助表達蛋白形成正確的二硫鍵，可增加蛋白的溶解性及活性。S6菌脂肪酶表達后上清中有明顯的條帶，可溶表達量達到50%，酶活達到2 000 U/mL，通過表達條件的優化可以進一步提高重組菌培養的細胞密度和可溶表達量，這一部分工作將另文發表。

脂肪酶LipS6為典型的堿性脂肪酶，其最適pH為9，比B106、B26脂肪酶的最適pH（8.0、8.5）高［13，17］，與H2菌脂肪酶最適pH一樣［19］，其在pH7-11范圍內穩定性好，穩定pH范圍寬。由于制漿造紙、皮革、紡織業的工藝特點，需要使用堿性脂肪酶來改善傳統工藝，LipS6的堿性最適條件及優越的堿性耐受性，顯示出其在這些領域的應用前景。前人對于短小芽孢桿菌脂肪酶的性質研究都沒有涉及其在非水相中催化合成反應的能力，本研究發現脂肪酶LipS6在非水相生物催化常用有機溶劑正己

烷中穩定性高，因此考察了其在正己烷中催化酯化的能力，發現其可以高效地催化脂肪酸與脂肪醇的酯化反應，這個性能的揭示預示著LipS6也可以應用于催化制備生物柴油。DMSO是非水相生物催化中常用的助溶劑，LipS6在25%的DMSO中仍能保持較高的酶活，這個性能將有助于開發LipS6在非水相中催化那些難溶底物的生物轉化。

4 結論

篩選獲得一株產脂肪酶的短小芽孢桿菌S6，通過PCR擴增獲得其全長基因大小為648 bp，利用pET32a質粒實現了其在大腸桿菌中的可溶表達，通過Ni-NTA親和純化后純酶的最適溫度為30℃，最適pH為9，耐堿性能優越，低濃度Ca2+、Mn2+對其有激活作用，在正己烷中穩定性高，于非水相體系中可以催化酯化反應。

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（責任編輯 李楠）

Gene Cloning，Expression and Characterization of the Lipase from Bacillus pumilus S6

Su Erzheng1Wu Xiangping2Gao Bei2Wei Dongzhi2
（1. Enzyme & Fermentation Technology Laboratory，College of Light Industry Science and Engineering，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037；2. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，New World Institute of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

A lipase-producing strain was screened from the soil samples. It was identified as Bacillus pumilus by the 16S rRNA method. According to the reported lipase genes from Bacillus, the primers were derived and the full-length gene was cloned, named “lipS6”, which had the size of 648 bp, encoding 215 amino acids. “lipS6” held 96% homology with the reported lipase gene B26. Recombinant plasmid pET32alipS6 was construced and expressed in E. coli. “lipS6”could be expressed in soluble form, and the lipase activity reached 2 000 U/L. The optimum temperature of recombinant lipase LipS6 was 30℃, and the optimum pH was 9. Low concentrations of Ca2+and Mn2+could activate the activity of lipase LipS6. The harmful effect of hydrophobic organic solvent on the lipase LipS6 was little. LipS6 could catalyze the esterification reaction in the n-hexane system, with the myristic acid and n-butanol as the optimum substrates. These properties show that LipS6 can be used in the fields of pulp and paper, leather, textiles and bioenergy.

Lipase Bacillus pumilus Gene cloning Recombinant expression Characterization

2013-12-23

國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）（2012AA020403），國家自然科學基金項目（31201296/C200101），生物反應器工程國家重點實驗室開放課題，南京林業大學引進高層次人才科研基金項目，江蘇高校優勢學科建設工程資助項目

蘇二正，男，博士，副教授，研究方向：分子酶學與生物催化；E-mail：ezhsu@njfu.edu.cn

蘇二正；魏東芝，男，博士，教授，研究方向：微生物工程、生物催化工程；E-mail：dzhwei@ecust.edu.cn