高同型半胱氨酸血癥對實驗性變態反應性腦脊髓炎小鼠的影響

張 祥 喬 健 (復旦大學神經病學研究所，上海 200040)

同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是一種含硫的非必需氨基酸，是蛋氨酸代謝的中間產物，它在體內的蓄積，可造成高同型半胱氨酸血癥(Hyper-homocysteinemia，HHcy)。HHcy 是心腦血管疾病重要的危險因素。然而，在多發性硬化(Mutiple Sclerosis，MS)等神經變性疾病中也發現存在HHcy［1-3］，其病理機制和意義目前還不清楚。實驗性變態反應性腦脊髓炎(Experiment autoimmune encephalomyelitis，EAE)是MS 較為理想的動物模型［4］。本研究旨在通過對伴或不伴HHcy 的EAE 小鼠的觀察，探討HHcy 在MS 中出現的原因及可能的病理意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 普通育成料M02(上海斯萊克實驗動物有限公司)，MOG35-55 肽段(北京聯科生物公司)，結核菌素(Mycobacterium Tuberculosis H37Ra，TB，DIFCO Laboratory)，百日咳毒素(Pertussis Toxin，PTX，List Biology Laboratory)，SBDF(同仁化學研究所)，蛋氨酸(Sigma-Aldreich 公司)，磷酸二氫鉀、甲醇、蘇木精-伊紅(HE)(國藥集團)，不完全弗氏佐劑(Sigma 公司)，IL-17、IFN-γ 和TNF-α 細胞因子ELISA 檢測試劑盒(eBioscience Company)。

1.2 實驗小鼠和飲食 健康雌性8 周齡C57BL/6小鼠20 只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，清潔級飼養，自由飲食，自然作息。以普通育成料M02喂養，其中10 只在制模前48 小時開始予飲水中添加4%蛋氨酸。

1.3 EAE 小鼠模型的建立及癥狀評估 稱取MOG35-55 肽段粉劑3 mg，溶于1 ml PBS 中;取5 mg TB，溶于1 ml 不完全弗氏佐劑;上述所制備的兩種液體以1 ∶1比例，采用針管混合器充分混合，制備成油包水樣乳白色混懸液。

分別取5 只有和沒有4% 蛋氨酸喂養的C57BL/6 小鼠，于背部脊髓二側四點皮下注射含MOG35-55 混懸液各50 μl，同時尾靜脈注射PTX 200 ng，48 h 后再次尾靜脈注射PTX 200 ng 加強免疫。每2 d 記錄小鼠體重，評估癥狀［0 分，無癥狀;1 分，垂尾;2 分，行路不穩/后肢力弱/翻正反射遲鈍;3 分，后肢麻痹和(或)前肢力弱;4 分，前肢麻痹;5 分，死亡］。

1.4 小鼠血漿Hcy 的測定 Hcy 采用高效液相色譜-熒光法檢測［1］。應用Waters 2690-2475 系統，衍生試劑為SBD-F，流動相為磷酸二氫鉀-甲醇，流速1 ml/min;色譜柱為ODS Hypersil 柱(250×4 mm，5 mm)，檢測器為熒光檢測器，激發波長385 nm，發射波長515 nm。

1.5 EAE 小鼠脾臟單個核細胞提取 EAE 小鼠頸椎脫臼處死，于無菌條件下取脾臟，并剪碎、研磨，100 目濾網過濾后，4℃，2 000 r/min 離心10 min，取沉淀，加入無菌水2 ml，渦旋振蕩40 s 破除紅細胞，加入無菌2.7% NaCl 溶液1 ml，迅速振蕩混勻靜止，待自然沉淀后取細胞懸液，4℃，2 000 r/min 離心5 min，棄去上清，用4℃無菌1×PBS 溶液洗滌2次，再次離心，細胞重懸于DMEM 中備用。

1.6 EAE 單個核細胞特異性免疫應答觀察 將細胞以1×106ml 接種于24 孔培養板中，培養液中加入MOG35-55(10 μg/ml)，培養48 h，留取上清，按照ELISA 試劑盒產品說明書對培養上清液中IL-17、IFN-γ、TNF-α 的含量進行測定。

1.7 統計學方法 采用SPSS11.5 統計學軟件對數據進行統計處理。各組數據用±s 表示。各組小鼠不同時間Hcy 平均濃度和體重變化的比較使用重復測量設計多因素方差分析進行統計，癥狀評分的比較采用非參數分析Mann-Whitney U 進行統計;各組小鼠細胞因子濃度比較使用t 檢驗進行統計。P＜0.05 為數據差異有統計學意義。

2 結果

本研究將實驗小鼠分為4 組，每組5 只:以普通育成料喂養的健康小鼠和EAE 小鼠(HC 組和EAE組)，添加蛋氨酸輔食的小鼠和EAE 小鼠(HC+Hcy組和EAE+Hcy 組)。

2.1 各組小鼠不同時間點Hcy 平均濃度的比較 如表1 所示，以普通育成料喂養的HC 和EAE 組小鼠的Hcy 平均濃度均分別顯著低于添加蛋氨酸輔食的HC+Hcy 和EAE+Hcy 組小鼠(P＜0.01)，提示添加蛋氨酸輔食可使C57BL/6 小鼠具有HHcy。EAE 制模被動免疫后的1～3 周，EAE 成模組(EAE和EAE+Hcy 組)小鼠血清中Hcy 濃度，分別與同喂養模式下的對照小鼠(HC 和HC+Hcy 組)相比，均無顯著統計學差異(P＞0.05)(表1，圖1)。提示小鼠在EAE 病理狀態下，并不會使體內Hcy 水平有明顯增加。

表1 各組小鼠不同時間點Hcy 平均濃度的比較(μmol/L)Tab.1 Mean levels of Hcy in mice from various groups at different time points (μmol/L)

圖1 各組小鼠不同時間點Hcy 平均濃度的比較Fig.1 Mean levels of Hcy in mice from various groups at different time points

表2 各EAE 成模小鼠不同時間點癥狀評分的比較Tab.2 Mean clinical scores of EAE mice from various groups at different time points

表3 各EAE 成模小鼠不同時間點體重(g)的比較Tab.3 Comparison of change of weight (g)of EAE mice from various groups at different time points

圖2 各EAE 成模小鼠不同時間點癥狀評分的比較Fig.2 Mean clinical scores of EAE mice from various groups at different time points

圖3 各EAE 成模小鼠不同時間點體重的比較Fig.3 Comparison of change of weights of EAE mice from various groups at different time points

2.2 各EAE 成模小鼠不同時間點癥狀評分和體重的比較 HC+Hcy 組小鼠在觀察期內并未出現明顯的運動障礙及體重減輕，說明單純添加蛋氨酸輔食并不會顯著干擾對小鼠癥狀的評估。各EAE 組小鼠于免疫后第9 天開始出現癥狀，并在3 周內癥狀逐漸加重。在免疫制模21 d，EAE+Hcy 組有1 只小鼠癥狀加重，發生死亡。自免疫制模后第15 天起始，各相應時間點EAE+Hcy 組小鼠癥狀評分及體重的下降均顯著高于EAE 組對照小鼠(P ＜0.05)(表2 和3，圖2 和3)。

小鼠運動障礙等癥狀評分及體重的變化，是評估EAE 嚴重程度重要指標。本實驗顯示EAE+Hcy組小鼠癥狀顯著重于EAE 組，提示HHcy 可顯著加重EAE 臨床癥狀表現。

2.3 各EAE 成模小鼠致炎因子水平的比較 于免疫后21 天，取各組EAE 小鼠脾臟單個核細胞，以MOG35-55 肽段刺激誘發特異性免疫反應，所測細胞因子水平顯示，EAE+Hcy 組小鼠TNF-α和IFN-γ 水平顯著高于EAE 組(P＜0.05)，而IL-17 水平在兩組中無顯著統計學差異(P＞0.05，圖4)。

3 討論

MS 是反復發作的，以腦、脊髓及視神經等多處受累為主的中樞神經系統脫髓鞘性疾病。盡管MS被認為是免疫相關性疾病，但有部分患者卻存在一些生化指標的異常波動，如尿酸、Hcy 等［1-3］，而這些指標的異常是否由MS 病理過程所致，是否會影響疾病的發展等，還缺少相關的研究。

本實驗結果顯示，EAE 組小鼠血漿中Hcy 水平并未顯著高于健康對照小鼠。有文獻報道，MS 的發病可能與某些病原體感染有關，如肝炎病毒、EB病毒等［5］。病原體感染激發機體免疫防御機制，由于病毒等病原體和中樞組織發生交叉免疫反應，從而使得機體產生相應抗體，造成MS 相關性的中樞織損傷［6］。由于EAE 模型由MOG35-55 肽段直接誘導產生細胞免疫所成，提示EAE 自身病理過程可能并不是產生HHcy 的原因。由此是否可推斷MS患者伴有HHcy 可能源于病原體對疾病的誘導階段，而不是產生于MS 患者體內免疫應答啟動后的階段。這一假設有待于進一步的研究證明。

圖4 不同EAE 組小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-17 因子水平的比較Fig.4 Comparison of levels of TNF-α，IFN-γ，IL-17 of EAE mice from various groups

EAE 具有類似MS 的臨床和病理表現，是被廣泛用于研究MS 的動物模型。可用以制作EAE 模型的動物有數種，包括C57BL/6 小鼠，而這種小鼠同時也可被用以制作HHcy。我們未查閱到以HHcy小鼠制作EAE 動物模型的報道。通過在飲水中添加4%蛋氨酸，C57BL/6 小鼠體內Hcy 水平在一周左右上升至同齡鼠的2～3 倍。以MOG35-55 肽段主動免疫，小鼠于免疫后9 d 左右出現垂尾、行路不穩等EAE 成模癥狀，表明采用以MOG35-55 肽段主動免疫和飲水中添加4%蛋氨酸的方式，可以制作具有HHcy 的EAE 小鼠模型。

同國外報道相一致［7，8］，我們預實驗中發現C57BL/6 小鼠在開始給予蛋氨酸輔食的10 天左右的時間內，其體重增長幅度較正常小鼠慢，但小鼠的日常活動未出現變化，而一般在2 周左右的時間，小鼠體重開始較穩定的增長(數據未列于本文)。本實驗顯示，HC+Hcy 組、EAE 組和EAE+Hcy 組小鼠在2 周內體重增長幅度未有顯著差異，而在免疫15 d 后，HC+Hcy 組小鼠體重繼續保持增長，EAE 組和EAE+Hcy 組小鼠體重則出現明顯下降，而后者下降的幅度更為顯著。結合EAE+Hcy 組小鼠癥狀評分更重于EAE 組這一結果，說明HHcy 可促進EAE 的發展。以往較多研究表明，Hcy 可損傷血腦屏障中的血管內皮細胞，同時還可以通過對內皮細胞功能影響，使其釋放因子，激活或是募集炎性細胞到達局部，進一步加強對血腦屏障的損傷，從而使更多致炎細胞進入中樞［9，10］。因此，HHcy 促進EAE 的發展可能同其對血腦屏障破壞有關，然而，Hcy 是否可直接影響免疫細胞的功能呢?

目前認為MS/EAE 是主要有T 細胞介導的免疫相關性疾病，輔助性T 細胞中的TH1 和TH17 是主要的致病細胞，前者主要分泌IFN-γ、TNF-α 等，后者則主要分泌IL-17 等［11］。通過對EAE 組和EAE+Hcy 組小鼠脾臟單個核細胞細胞因子水平的比較，我們發現Hcy 可以促進EAE 小鼠TNF-α 和IFN-γ 的產生，而對IL-17 無顯著影響。因此，Hcy可能主要通過促進TH1 細胞相關致炎因子，而不是TH17 細胞相關致炎因子，而增強T 細胞的致病作用，使MS/EAE 的臨床癥狀加重。此結果也佐證了近年來有關Hcy 可影響機體免疫的報道。有研究表明，Hcy 除可以促進T 細胞的增殖［12］，還可通過T淋巴細胞等表面的NMDA 受體，使鈣離子流入細胞增多，促進胞內ROS 聚集，激活蛋白C、一氧化氮合成酶以及NADPH 氧化酶等，使IFN-γ 等炎性因子產生增多等［13-15］。

總之，通過對伴或不伴有HHcy 的EAE 小鼠模型的觀察，我們沒有發現EAE 疾病過程中Hcy 水平的明顯升高，但HHcy 可以加重EAE 的臨床癥狀，其機理可能同Hcy 破壞血腦屏障，促進TH1 細胞分泌TNF-α、IFN-γ 等致炎因子有關。目前，Hcy 對機體免疫影響的研究還較為局限，隨著對此問題的深入研究，將有助于進一步闡明MS 患者中存在HHcy的原因及其意義。

［1］張 祥，呂傳真，喬 健，等.高同型半胱氨酸血癥與多發性硬化的關系初探［J］.中國臨床神經科學，2007，15(5):486-489.

［2］劉 敏，彭 海.高同型半胱氨酸與神經變性性疾病［J］.國外醫學(衛生學分冊)，2005，32(5):274-277.

［3］Zoccolella S，Tortorella C，Iaffaldano P，et al.Elevated plasma homocysteine levels in patients with multiple sclerosis are associated with male gender［J］.J Neurol，2012，259(10):2105-2110.

［4］Robinson AP，Harp CT，Noronha A，et al.The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)model of MS:utility for understanding disease pathophysiology and treatment［J］.Handb Clin Neurol，2014，122:173-189.

［5］Cusick MF，Libbey JE，Fujinami RS.Multiple sclerosis:autoimmunity and viruses［J］.Curr Opin Rheumatol，2013，25 (4):496-501.

［6］Chastain EM，Miller SD.Molecular mimicry as an inducing trigger for CNS autoimmune demyelinating disease［J］.Immunol Rev，2012，245(1):227-238.

［7］Velez-Carrasco W，Merkel M，Twiss CO，et al.Dietary methionine effects on plasma homocysteine and HDL metabolism in mice［J］.J Nutr Biochem，2008，19(6):362-370.

［8］Zhou J，Werstuck GH，Lhotak S，et al.Hyperhomocysteinemia induced by methionine supplementation does not independently cause atherosclerosis in C57BL/6J mice［J］.FASEB J，2008，22(7):2569-2578.

［9］Alkhoury K，Parkin SM，Homer-Vanniasinkam S，et al.Chronic homocysteine exposure upregulates endothelial adhesion molecules and mediates leukocyte:endothelial cell interactions under flow conditions［J］.Eur J Vasc Endovasc Surg，2011，41 (3):429-435.

［10］Kamath AF，Chauhan AK，Kisucka J，et al.Elevated levels of homocysteine compromise blood-brain barrier integrity in mice［J］.Blood，2006，107(2):591-593.

［11］El-Behi M，Rostami A，Ciric B.Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Neuroimmune Pharmacol，2010，5(2):189-197.

［12］Dai J，Wang X.Immunoregulatory effects of homocysteine on cardiovascular diseases［J］.Sheng Li Xue Bao，2007，59 (5):585-592.

［13］Boldyrev AA，Bryushkova EA，Vladychenskaya EA.NMDA receptors in immune competent cells［J］.Biochemistry (Mosc)，2012，77(2):128-134.

［14］Dawson H，Collins G，Pyle R，et al.The immunoregulatory effects of homocysteine and its intermediates on T-lymphocyte function［J］.Mech Ageing Dev，2004，125(2):107-110.

［15］Schroecksnadel K，Frick B，Wirleitner B，et al.Moderate hyperhomocysteinemia and immune activation ［J］.Curr Pharm Biotechnol，2004，5(1):107-118.