慢性丙型肝炎患者樹突狀細胞體外培養后IL-12、INF-γ水平變化

徐 麗，劉積平，吳曉燕，李修范，楊樂清，閆慧梅，崔憲影

慢性丙型肝炎患者樹突狀細胞體外培養后IL-12、INF-γ水平變化

徐 麗，劉積平，吳曉燕，李修范，楊樂清，閆慧梅，崔憲影

目的探討慢性丙型肝炎患者樹突狀細胞(dendritic cells，DC)體外培養后細胞因子IL-12、INF-γ水平變化。方法選擇32例慢性丙型肝炎患者作為觀察組，30例健康體檢者作為對照組，分別取抗凝血50 ml，經過DC體外培養后留取上清液5 ml備檢，用ELISA試劑盒檢測兩組培養前、后細胞因子IL-12、INF-γ的水平變化。結果觀察組實驗前血清中細胞因子IL-12為(38.46±4.97)ng/L，INF-γ為(15.27±2.67)pg/ml，對照組分別為(61.10±4.38)ng/L、(27.24±1.79)pg/ml ，兩組差異有統計學意義(P<0.01)。觀察組DC培養后上清液中IL-12為(337.91±13.35)ng/L，INF-γ水平為(6076.72±403.43)pg/ml，對照組分別為(661.44±52.99)ng/L、(10 449.00±626.54)pg/ml ，兩組差異有統計學意義(P<0.01)。結論體外培養后DC分泌IL-12、INF-γ水平明顯高于培養前，提示通過DC培養提高細胞因子水平誘導細胞免疫，可作為慢性丙型肝炎的一種新型輔助療法。

慢性丙型肝炎；樹突狀細胞；IL-12；INF-γ

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染所引起的傳染性疾病。近年來許多研究表明，免疫因素，尤其是細胞免疫異常可能是丙型肝炎發病的重要機制，并且細胞因子在其中起著至關重要的作用。抗病毒免疫應答是一個復雜的過程，有許多免疫細胞和免疫因子參與，其中樹突狀細胞(DC)在機體抗病毒免疫應答中發揮著中心作用，DC為產生IL-12的主要細胞，IL-12是促進Th0向Th1分化的細胞因子，作為誘導機體天然免疫和獲得性免疫的核心環節，DC在控制丙型肝炎病毒的感染及清除病毒的過程中起重要作用[1]。近年來，隨著生物免疫技術的發展，樹突狀細胞的體外培養技術也逐漸成熟。因此，本研究觀察慢性丙型肝炎患者樹突狀細胞體外培養前后血清及上清液中細胞因子IL-12、INF-γ水平變化，探討該變化與丙型肝炎病毒持續感染的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2010-09至2012-06在本院門診、住院診斷為輕度慢性丙型肝炎患者32例作為觀察組，男20例，女12例，年齡18～65歲，丙型肝炎病毒標志物均陽性，103 Copies/ml

1.2 儀器與試劑 CO2細胞培養箱BC-JL60S，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。低速臺式大容量離心機TDL-40C，上海安亭科學儀器廠。潔凈工作臺VS-840-2，上海博迅實業有限公司醫療設備。用ELISA試劑盒檢測細胞因子：IL-12、INF-γ試劑購于上海森雄科技有限公司進口分裝(按說明書操作)。微量加樣槍(上海球精生化試劑有限公司)，高級酶標儀(瑞士 TecanSU NRISE公司)。PCR檢測儀器、試劑均由雅培公司提供。丙型肝炎抗體用化學發光法測定，試劑由北京源德生物有限公司提供。

1.3 方法及標本檢測 (1)觀察組及對照組分別抽取5 ml靜脈血，提取血清，冷凍-20℃冰箱中備檢。(2)兩組分別抽取肝素抗凝的外周靜脈血50 ml，用密度梯度離心及粘壁法獲得單核細胞。DC的誘導培養方法參照文獻[3]進行，并作適當修改：在37 ℃和5%CO2濃度的條件下，用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4等細胞因子誘導擴增出DC，使其成為抗HCV-DC。于培養第7天取上清液5 ml，冷凍-20 ℃冰箱中備檢。(3)檢測兩組培養前血清中細胞因子IL-12、INF-γ水平及DC體外培養后上清液IL-12、INF-γ水平。

2 結 果

觀察組實驗前血清中細胞因子IL-12為(38.46±4.97)ng/L，INF-γ水平為(15.27±2.67)ng/L，對照組分別為(61.10±4.38)ng/L、(27.24±1.79)ng/L，兩組差異有統計學意義(P<0.01)。觀察組DC培養后上清液中IL-12為(337.91±13.35)ng/L，INF-γ水平為(6076.72±403.43)ng/L，對照組分別為(661.44±52.99)ng/L、(10 449.00±626.54)ng/L，兩組差異有統計學意義(P<0.01)。丙型肝炎觀察組血清及DC培養后上清液IL-12、IFN-γ水平均明顯低于對照組；兩組DC體外培養后上清液中IL-12、INF-γ水平均明顯高于實驗前血清中IL-12、INF-γ的水平。

3 討 論

DC是目前所知的最強的抗原提呈細胞(APC)，它能夠誘導免疫應答并能夠維持對自身抗原和非自身抗原的免疫耐受，在啟動有效的抗病毒T細胞應答中扮演重要角色。T細胞是產生IFN-γ的主要細胞，DC為產生IL-12的主要細胞。IL-12作為IFN-γ的誘生因子，其水平的下降將引起IFN-γ水平的降低。IL-12、IFN-γ主要參與對APC、巨噬細胞、NK細胞、B細胞的膜分子表達、活化和分化進行免疫調節，協同IL-2誘導NK細胞增殖及LAK細胞產生，促進同種異體細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic tlymphocyte,CTL)的反應[4]。機體不能誘導強大的、有針對性的CTL反應可能與HCV-DC功能缺陷，產生IL-12和IFN-γ的能力受損有關[5]。總之，DC的功能狀態在HCV患者機體抗病毒免疫應答中發揮著中心作用[6]。

本實驗結果顯示，丙型肝炎觀察組血清及DC培養后上清液IL-12、IFN-γ水平均明顯低于對照組；兩組DC體外培養后上清液中IL-12、INF-γ水平均明顯高于實驗前血清中IL-12、INF-γ的水平，差異均有統計學意義(P<0.01)。本實驗結果顯示，由于慢性丙型肝炎患者的DC功能低下，導致其血清及DC體外培養后IL-12、INF-γ的水平均明顯低于健康人。DC功能低下導致的免疫功能下降，是HCV患者抗HCV免疫應答水平較低的原因之一，可能與丙型肝炎慢性持續感染相關，這為生物免疫療法用于慢性丙型肝炎的治療提供了科學依據。

觀察組與對照組DC體外培養后上清液中IL-12、INF-γ水平均明顯高于實驗前水平，說明此種體外培養方法可以提高慢性丙型肝炎患者DC的功能狀態，從而提高了IL-12、INF-γ的水平。通過檢測DC體外培養后上清液中IL-12、INF-γ的水平，了解HCV感染者體內DC的功能狀態，能夠為揭示DC與慢性丙型肝炎患者HCV持續感染的關系提供實驗依據。

總之，慢性丙型肝炎患者能否通過DC體外培養回輸，提高DC功能，誘導細胞免疫，提高抗病毒的能力，是目前生物免疫治療亟待解決的問題。本研究尚屬體外實驗，由于例數較少，觀察時間較短，還有待于進一步研究予以證實。

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[5] 王穎萍，黨冬梅.樹突狀細胞免疫功能與慢性丙型肝炎病毒感染相關分析[J].內蒙古醫學雜志,2012,44(1):17-18.

[6] Zammit D J,Lefrancois L.Dendritic cell- T cell interactions in the generation and maintenance of CD+8T cell memory[J].Microbes Infect, 2006,8(4):1108-1115.

(2013-06-09收稿 2013-08-12修回)

(責任編輯 尤偉杰)

ChangesinlevelsofIL-12andINF-γaftercultureinvitroofdendriticcellsofpatientswithchronichepatitisC

XU Li, LIU Jiping, WU Xiaoyan, LI Xiufan, YANG Leqing, YAN Huimei, and CUI Xianying.
Department of Lemology, Jilin Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Changchun 130052, China

ObjectiveTo study the changes in levels of cytokines IL-12 and INF-gamma in patients with chronic hepatitis C after cultureinvitroof dendritic cell (DC).MethodsThirty-two patients with chronic hepatitis C were recruited as the observation group, and 30 healthy subjects undergoing physical examination as the control group, 50 ml of anticlotting blood was taken separately. After culture of DCinvitro, 5 ml of supernatant fluid were returned for examination. Using ELISA kit, the cytokines IL-12, INF-gamma level changes before and after culture in the two groups were examined.ResultsIn the observation group, before the experiment, serum cytokine IL-12 was (38.46±4.97) ng/L and IFN - gamma was (15.27±2.67) pg/ml; in the control group, the cytokines were (61.10±4.38) ng/L and (27.24±27.24) pg/ml, respectively; the difference between the two groups was statistically significant (P<0.01). In the observation group, after culture of DC, IL-12 in the supernatant fluid was (337.91±13.35) ng/L, IFN-gamma was (6076.72±403.43) pg/ml; in the control group, the cytokines were (661.44±52.99) ng/L and (10 449.00±626.54) pg/ml, respectively; the difference between the two groups was statistically significant (P<0.01).ConclusionsAfterinvitroculture of DC, secretion of IL-12, and the INF-gamma is obviously higher than that before culture, suggesting that raising the level of cytokines induced by DC immune cells can be used as a new auxiliary therapy in the treatment of chronic hepatitis C.

chronic hepatitis C; dendritic cells; IL-12; INF-gamma

徐 麗，本科學歷，主任醫師，E-mail：ylq1027@163.com

130052長春，武警吉林總隊醫院傳染科

R512.63