泛素蛋白酶體系統與大腸癌

陳世敏，王啟棟 綜述 胡成進 審校

泛素蛋白酶體系統與大腸癌

陳世敏1，王啟棟2綜述 胡成進1審校

泛素蛋白酶體系統；大腸癌；發生發展；預后

泛素蛋白酶體系統(ubiquitin proteasome system，UPS)，是哺乳動物細胞內主要的蛋白質調控系統，可高效并高度選擇性地進行細胞內蛋白質的降解，參與和調控多種細胞生物學過程，如細胞周期、基因轉錄、抗原提呈、細胞分化和凋亡等，對維持細胞的正常生理功能具有重要意義[1]。目前發現的許多遺傳性和獲得性疾病(如腫瘤、囊性纖維化)的發生都與該系統功能失調有關。同時，隨著一些與泛素蛋白酶體途徑相關致病蛋白被發現，探討通過調控該途徑進行大腸癌等相關疾病的治療也逐漸受到人們的關注，并已成為一個熱門領域。

1 泛素蛋白酶體系統的組成及功能

泛素蛋白酶體系統由泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin activaing enzyme，E1)、泛素結合酶(ubiquitin conjugating enzymes，E2)、泛素連接酶(ubiquitin ligating enzyme，E3)和蛋白酶體(proteosome)組成[2]。泛素蛋白酶體系統介導的蛋白質降解實際上是泛素活化酶E1、泛素轉移酶E2和泛素蛋白連接酶E3參與的多步酶促反應，在目的蛋白底物的特異性氨基酸殘基上加上泛素，完成蛋白底物(主要是細胞自身產生的蛋白)的泛素化，然后再通過26S蛋白酶體的催化，使其變成短肽片段。

1.1 泛素 泛素是由76個氨基酸組成的高度保守的小分子蛋白，是泛素蛋白酶體系統的重要組分。泛素具有標簽樣作用，通過共價結合到靶蛋白上而引起蛋白的特異性降解。泛素包含7個參與泛素連接的賴氨酸受體，能產生不同拓撲結構、不同長度和功能的泛素鏈[3]。 例如，泛素鏈通過泛素48位賴氨酸的結合導致被修飾底物的蛋白酶體降解，而63位賴氨酸的泛素連接卻意味著信號轉導或者運輸事件。

1.2 泛素活化酶E1 泛素活化酶是泛素與底物蛋白結合所需的第一個酶。利用水解ATP釋放的能量與泛素的羧基末端的甘氨酸殘基形成高能硫酯鍵而激活泛素，為細胞的活性和生存所必需[2]。

1.3 泛素結合酶E2 泛素結合酶是泛素與底物蛋白結合所需的第二個酶。通過轉酰基作用將活化的泛素進一步轉移到泛素結合酶特異的半胱氨酸殘基上形成Ub-E2中間體[2]。目前已識別的參與UPS的E2酶至少有50個以上。

1.4 泛素連接酶E3 泛素連接酶是泛素與蛋白底物結合所需的第三個酶，能特異性識別底物蛋白，使底物蛋白發生選擇性泛素化。泛素可以直接從E2轉移給特定的靶蛋白形成泛素-蛋白復合物，而在大多數情況下，靶蛋白先與泛素連接酶特異性結合，E3可使E2和靶蛋白相互接近，繼而泛素從E2酶轉移到靶蛋白的賴氨酸殘基上，完成靶蛋白的泛素化[1,2]。多個泛素分子重復地附加到靶蛋白上，則形成多Ub鏈蛋白質。

1.5 蛋白酶體 蛋白酶體是由多個亞單位組成的蛋白酶復合體，沉降系數為26S，故又稱26S蛋白酶體。主要負責對多聚Ub鏈蛋白質的識別和降解。26S蛋白酶體組成包括20S催化顆粒、11S調控因子和2個19S調節顆粒，是ATP依賴性蛋白水解酶復合體[4]。在UPS中，各種泛素化的靶蛋白質先被26S蛋白酶體的19S亞單位識別，隨后泛素化靶蛋白脫泛素鏈和變性，進入20S亞單位的筒狀結構內被降解為短肽片段。

2 UPS與大腸癌的發生發展

真核細胞內大多數蛋白質降解過程的調控是通過UPS進行的。近年來隨著對UPS研究的深入，發現其不僅在真核細胞增殖、凋亡、血管生成、運動等正常生理過程中起著重要的作用，而且該系統異常造成細胞內重要功能蛋白質的降解失常與惡性腫瘤的發生和發展有著密切的關系。

2.1 UPS調控結腸上皮細胞的增殖和分化 Wnt信號途徑在大腸癌發展中起重要作用，調控大腸癌上皮細胞的增殖和持續更新。研究表明，約90%的大腸癌發生與該通路過度激活有關[5]。泛素蛋白酶體系統在Wnt信號轉導途徑中起著重要調控作用。已經明確有多個E3泛素連接酶參與該調控過程[7]。經典Wnt信號轉導途徑致癌的關鍵是該途徑任何一個信號分子異常致β-catenin在胞質中累積，繼而進入核內激活TCF-4 (T cell factor-4,TCF-4)轉錄因子，啟動靶基因轉錄，因此經典Wnt信號轉導途徑又稱為Wnt/β-catenin信號轉導途徑。Wnt信號在結直腸上皮細胞和癌病變中的重要作用可能還來自另外一個Wnt調控轉錄因子Hath1。Hath1是基本的螺旋-環-螺旋轉錄因子能促進大腸癌上皮細胞的分化和胃腸道杯狀細胞的黏蛋白產出，在反向β-catenin 路徑中受蛋白酶體降解調控。Wnt信號推進GSK3β(為了后續的泛素化參與β-catenin磷酸化) 遠離β-catenin的平衡并磷酸化Hath1，使之隨后泛素化并被蛋白酶體降解[8]。總之，UPS在轉錄因子β-catenin和Hath的作用發揮上起關鍵作用，指導兩條不同的轉錄程序并調控結直腸上皮細胞的增殖與分化。

2.2 UPS調控結直腸發病機制的常見損害 在導致大腸癌病變的諸多分子損害中，主要包括APC(adenomatous polyposis coli，APC)基因突變，激活β-catenin的轉錄，k-ras基因突變和Smad4(DPC4)基因突變。這些與大腸癌癌變相關的改變都是在UPS的調控下進行的[9]。

APC突變是正常上皮向病理損害過渡的主要事件之一。APC是履行β-catenin磷酸化復合物的組成部分，而β-catenin的磷素化是為了轉錄因子的泛素化從而被蛋白酶體識別而降解。

大腸癌中k-ras突變的激活引發數個致癌基因轉導途徑的激活。Raf激酶被k-ras觸發激活MAPK級聯反應導致轉錄因子AP1的激活。轉錄因子c-jun和c-fos的組成和ERK3級聯激酶是蛋白酶體底物。PI3K激酶也是k-ras的激活靶標，它的活化能導致akt激酶的激活。Akt是mdm2 (p53的E3連接酶), Bad (bcl-2家族的抗凋亡成員),caspase 9和GSK3β激酶以及轉錄因子FKHR等眾多靶標的絲氨酸/蘇氨酸激酶[6]。通過這些靶標效應，akt抑制凋亡，促進增殖。akt和磷酸酯酶PTEN及其抑制藥都是蛋白酶體底物。

Smad4是TGFβ信號途徑的傳感器，頻繁地參與到大腸癌的發病機制中，也是蛋白酶體的作用底物。大腸癌中另一個腫瘤抑制因子p53突變以及p53的同家族蛋白質p73和p53的輔因子ASPP/53BP2也是蛋白酶體底物。

由此可知，蛋白酶體在不同水平通過多個途徑調控大腸癌的病變。

2.3 UPS組成和底物是大腸癌的預后因子 考慮到UPS在多種結直腸癌變過程中的重要角色，對于該系統的組成和蛋白底物在不同侵襲性大腸癌病例個體差異表達并提供預后信息應不足為奇。

β-轉導重復蛋白 (β-Transducin repeat-Containing Protein，β-TrCP)是涉及到β-catenin 蛋白酶體降解的E3連接酶。β-TrCP還是β-catenin /TCF4轉錄的靶基因，在大腸癌患者APC突變激活β-catenin的情況下，β-TrCP表達上調并且使蛋白酶體降解體系失去作用。研究顯示β-TrCP水平增加與大腸癌細胞β-catenin激活，核NF-κB活性以及凋亡減少有關，而且大腸癌轉移患者腫瘤中β-TrCP mRNA水平高于大腸癌無轉移患者[10]。

與大腸癌預后有關的另一個E3泛素連接酶復合物成員是Skp2 (S期蛋白激酶2)。Skp2與調控蛋白Cks1 (細胞周期依賴激酶亞單位1)受Cdk抑制劑p27泛素化的影響。在大腸癌預后差的患者中可觀察到這兩種蛋白的過表達[11]。Skp2和Cks1與大腸癌患者的生存顯著相關，并且獨立于腫瘤所處階段和惡性等級。p27是Skp2和Cks1的泛素化靶標。目前關于p27表達關系到大腸癌轉移及生存預后的研究報道有很多，而且普遍認為大腸癌轉移患者p27下調原因在于p27蛋白降解增加，由于細胞周期不同階段p27 mRNA水平保持穩定，因此p27不是在轉錄水平被調控，而是在蛋白質的穩定性和降解水平通過磷酸化、泛素化和蛋白酶體降解完成[12]。而E3泛素連接酶復合物成員Skp2和Cks1過表達(及其可能附加的機制)導致p27穩定性降低和腫瘤侵襲性增加是大腸癌患者調控失敗病情轉移惡化的主要原因之一[13]。

3 UPS與大腸癌新藥研發

大腸癌是最常見的腫瘤之一，由于飲食的原因發達國家的發病率高于發展中國家。盡管過去的幾十年中引入了數種治療大腸癌的新藥物延長了早期患者的生命，但是轉移性大腸癌仍是致命的，急需新的治療藥物。世界范圍內針對該病活躍著數個研究路線，其中基于泛素蛋白酶體系統的級聯反應特點，特異性干涉UPS的某一環節已被認為是一種很有前途的創新性抗腫瘤治療方法，已逐漸成為大腸癌治療研究的焦點[14]。

3.1 蛋白酶體抑制藥治療大腸癌的研究 考慮到蛋白酶體在包括腫瘤形成調控的細胞調控上的重要作用，許多研究已經著眼于蛋白酶體抑制因子對大腸癌的作用上。已經獲得了對多發性骨髓瘤治療調控的認可的蛋白酶抑制藥硼替佐米(Bortezomib)，目前已被廣泛地用于包括大腸癌在內的其他實體瘤的治療研究[15]。目前大家更關注通過聯合治療方式進行大腸癌的治療。實際上，Bortezomib和其他藥物的聯合是進一步開發大腸癌藥物最有效的方法，而且已經著手開發。基于臨床前期體外蛋白酶體抑制劑與拓撲異構酶Ⅰ抑制因子的聯合，如今正在進行Bortezomib和依立替康擴大劑量的Ⅰ期研究。下一步對Bortezomib用于大腸癌的開發將研究其與大腸癌治療藥物如奧沙利鉑，依立替康或者氟脲嘧啶及其同系物在嚴重缺少預治療處理患者的聯合應用，可能會附加沒有明顯疊加毒性的靶向抗VEGF或者抗EGFR的治療如貝伐單抗，西妥昔單抗或者帕尼單抗。另一個策略是聯合Bortezomib和已確定的新型定向治療的細胞毒素藥物，如Cox抑制因子或者脫乙酰基酶抑制因子聯合用于大腸癌的治療。

3.2 泛素連接酶作為大腸癌治療靶標的潛力 泛素連接酶介導特異性底物的降解，因此最初認為靶定E3酶活性位點或者酶與底物的連接可能設計出不良反應較少的選擇性藥物。目前研究充分的一個明顯靶點是具有致癌能力的RING型E3酶Hdm2, 腫瘤抑制蛋白p53的關鍵性負調控因子，調控細胞周期進展的多亞單位SCF連接酶。以Hdm2為靶點的研究試驗了各種方法，包括抑制其表達，封閉其泛素連接酶活性和阻止Hdm2和p53間的相互作用以及能特異性靶定Hdm2的E3連接酶活性的小分子抑制劑的產生。另一個明顯的靶點是Skp2，SCF連接酶復合物的底物特異性亞單位，它的失活在表達低水平的細胞周期抑制因子p27的腫瘤中可能是有益的。發展連接酶抑制藥的另一個策略是識別能結合蛋白底物并能阻止多個連接酶行為的小分子，然后建立能特異性靶定野生型或者突變底物變異株的抑制藥。如小復合物RITA(2,5-雙(5-羥甲基-2-噻吩)呋喃)能結合p53的氨基末端并促進生長停滯[16]。目前，一種調控cullin-RING亞型泛素連接酶的小分子抑制因子“NEDD8-激發酶”的研究已進入臨床一期試驗[16]。總之，圍繞泛素連接酶的抗腫瘤治療為開發新的治療策略帶來了希望。

隨著蛋白酶體抑制藥和泛素連接酶相關藥物的成功研發，E1抑制藥作為有效的治療靶標也逐漸受到關注。Millennium制藥和Rigel制藥已經公布了他們發現并獲得專利的E1抑制藥。這些泛素激活有關的小分子抑制藥也成為癌癥治療的潛力軍。

隨著對UPS結構功能和重要的泛素網絡調控作用的深入了解，通過調控該途徑控制大腸癌的發生發展，改善患者預后以及開發出UPS抑制因子用于大腸癌的藥物治療將成為可能。

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(2013-10-09收稿 2013-12-20修回)

(責任編輯 梁秋野)

山東省科技發展計劃項目(2008GG30002030)

陳世敏，博士，副主任技師，E-mail: happycsm@163.com

1. 250031濟南，濟南軍區總醫院實驗診斷科；2. 102612北京，武警后勤部疾病預防控制中心

胡成進，E-mail：hcj6289@163.com

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