補體在單克隆抗體介導的腫瘤免疫治療中的作用

顧 勇，笪晨星 綜述 孟宏濤 審校

綜述

補體在單克隆抗體介導的腫瘤免疫治療中的作用

顧 勇，笪晨星 綜述 孟宏濤 審校

單克隆抗體；免疫治療；補體；膜結合的補體調節蛋白

使用單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)的免疫治療，作為一種抗腫瘤的治療方法具有良好的應用前景，因為它能特異性靶向腫瘤細胞，卻對周圍正常組織沒有作用。這相對于非特異性的化療和放療是一個很重要的優點。鑒于此，筆者闡述抗體誘導的補體介導的效應機制、腫瘤細胞逃避補體損傷以及補體活化和調節，同時闡述mAb治療腫瘤的現狀、存在的問題，以及通過改進更好的使用補體系統增強治療性的mAbs的臨床作用。

1 mAb介導的腫瘤免疫治療

1.1 治療現狀概述 近年來，嵌合和人源化的mAbs已被批準使用于治療腫瘤、自身免疫性疾病和移植排斥。FDA批準的第一個可在人體使用的mAb是鼠的抗-CD3 mAb莫羅單抗(muromonab，OKT3)，用于治療器官的移植排斥反應。但是，OKT3半衰期短且具有強烈的免疫原性，因此在人體使用時達不到預期最佳效果。1984-1988年間，構建了一些嵌合的和人源化的mAbs。1997年，產生了第一個獲準用于腫瘤治療的mAb利妥昔單抗(rituximab，rituxanTM)。隨后，又有數種mAbs獲準用于腫瘤的治療，并且有多種在進行臨床前期或臨床評價。

1.2 部分mAb的作用 利妥昔單抗是可結合至人B淋巴細胞的嵌合的IgG1抗-CD20 mAb，已批準用于治療諸如非霍奇金淋巴瘤的B-細胞的惡性疾病，可單獨使用也可聯合化療使用[1]。該藥的作用機制包括抗體依賴細胞的細胞毒性效應(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)、補體依賴的細胞毒性效應(complement-dependent cytotoxicity，CDC)、生長抑制、Fas誘導凋亡和增加腫瘤細胞的化療和放療敏感性[2]。

目前，FDA批準用于治療消化道腫瘤的mAbs主要有以下三種。

1.2.1 西妥昔單抗(cetuximab，erbitux TM) 是直接針對EGFR家族中Her-1的嵌合IgG1[3]。西妥昔單抗在2004年獲得FDA認證用于結直腸癌的治療，且在過表達EGFR的頭頸部腫瘤的患者中也進行了療效評價。它可抑制Her-1表達細胞的增殖，通過抑制有絲分裂活性蛋白激酶(mitogenactivating protein kinase，MAPK)/PI3K/Akt 信號通路上調p27KIP1的表達，從而誘導凋亡；它也能抑制VEGF的產生，介導ADCC和CDC[3，4]。

1.2.2 貝伐單抗(bevacizumab，avastinTM) 是靶向VEGF人源化的抗血管生成的mAb (IgG1)[5]，但是對腫瘤細胞本身很少有細胞毒性[6]。2004年，FDA批準貝伐單抗聯合氟尿嘧啶作為轉移性結直腸癌的一線治療。

1.2.3 帕尼單抗(panitumumab，vectibixTM) 是直接針對EGFR 的人源性的IgG2[7]。 2006年，FDA批準panitumumab用于轉移性結直腸癌的治療。帕尼單抗主要通過誘導凋亡、降低致炎細胞因子和VEGF的生成從而抑制腫瘤細胞的生長[7]。

1.3 存在的問題 早期使用多克隆抗體進行免疫治療很受限制，原因在于抗體在體內難以達到所需的滴度，且特異性存在免疫原性問題。將鼠的mAb引入免疫治療后可提高抗體的滴度和特異性[8]。通過基因工程技術產生鼠人的嵌合抗體，即將鼠的可變區融合入人的恒定區，可部分解決多克隆抗體所致的免疫原性問題，例如利妥昔單抗。盡管嵌合抗體降低了免疫原性，它們仍然能夠誘發明顯的免疫應答。繼而產生了人源化的抗體，即將可變區中結合抗原的互補決定區(complementary determining regions，CDRs)轉移入人的框架結構中[9]。

值得注意的是， FDA批準用于腫瘤治療的許多mAbs可在體外激活補體并介導CDC，如上述的利妥昔單抗和西妥昔單抗。mAb介導的補體活化可直接導致腫瘤細胞的裂解或者增強抗體依賴細胞介導的細胞毒效應。然而，腫瘤細胞可通過在腫瘤細胞高表達的膜結合補體調節蛋白(membrane-bound complement regulatory proteins，mCRP)的保護作用免于補體介導的損傷。近來研究表明，封閉或極限最大化腫瘤細胞mCRP的功能可增強mAb的免疫治療作用，這為增強mAbs的抗腫瘤活性，改善臨床治療效果提供了新的思路。

2 補體在腫瘤免疫治療中的作用

2.1 腫瘤細胞殺傷作用 補體系統是天然免疫的重要組成部分，參與宿主防御傳染性病原體的感染，它在清除免疫復合物和凋亡細胞中也起重要作用。腫瘤細胞也可能是補體系統的潛在靶點之一。補體系統需要活化以釋放能識別和攻擊腫瘤細胞的生物活性產物。抗體介導的經典通路的活化將補體活化產物靶向至腫瘤細胞，從而導致細胞損傷的最有效方式。

補體系統相對于其他防御系統的優勢，在于它們由可溶性分子組成，因此易于達到腫瘤部位并彌散入腫瘤塊內。并且大部分補體系統可在局部由許多類型的細胞合成，諸如巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞，從而易于在防御的第一時間內獲得。

2.2 補體系統抑制作用 抗體介導的補體依賴的殺傷效應對于腫瘤細胞來說并不是有效的機制，這是因為在腫瘤細胞上有補體調節蛋白(complement regulatory proteins，CRPs)的過表達，從而保護腫瘤細胞免于補體的攻擊。CRPs在許多腫瘤細胞和細胞系的表面均表達。它們在補體級聯的不同階段控制補體活化，并且對于C3b的沉積、C5a的生成和MAC介導的細胞裂解具有有效的抑制效應[10]。CD46， CD55 and CD59 被認為是最重要的mCRPs，它們在正常細胞和腫瘤細胞均表達，而CD35的作用主要限于血細胞和腎小球足細胞。

總之，補體系統在腫瘤的免疫治療中起重要作用，對于腫瘤的手術、化療和放射治療來說是一個重要補充，尤其在控制微小的殘留病灶方面。當然，也需要一些優化條件使得補體更為有效，其中包括腫瘤細胞表面表達的腫瘤抗原水平、抗體種類和降低補體抑制物的表達。因此，將補體作為腫瘤免疫治療的效應系統，應中和經常在腫瘤細胞中過表達的補體調節蛋白的抑制作用，并闡明這些細胞逃避補體攻擊的機制。

3 補體在mAb介導的免疫治療中的作用

補體系統在控制腫瘤生長方面的作用長期受到忽視，這是因為主要強調的是對于腫瘤的細胞介導的免疫應答。隨著將mAb用于腫瘤治療，補體作為效應系統所起的作用日益受到重視。迄今為止，用mAbs治療惡性疾病已取得某些成功。然而，大體來說，臨床效果離預期療效還有很大差距。

3.1 補體介導效應機制 大部分mAbs在介導ADCC時也激活補體系統[11]。補體可啟動三種機制對抗mAb包被的腫瘤細胞：(1)通過MAC直接補體殺傷腫瘤細胞，此過程通常也稱作CDC；(2)ADCC在此情況下，CR3結合至iC3b，繼而增強FcγR介導的效應細胞的結合；(3)用于殺傷微生物，CR3依賴的細胞毒作用(CR3-dependent cellular cytotoxicity，CR3-DCC)，此種機制通常在腫瘤中并不起作用[12]。

3.2 補體募集作用 FDA批準用于腫瘤治療的許多mAbs可在體外激活補體。Mouse-anti-Ep-CAM(epithelial cell adhesion molecule，Edrecolomab)和humanized anti-CD52(Alemtuzumab)在體外活化補體系統并活化ADCC[13]。嵌合的鼠anti-CD20 mAbs在體外通過ADCC和CDC發揮抗癌作用[14，15]。然而，現在臨床使用中的其他mAbs的作用機制并不能證明補體參與了腫瘤縮小的機制。mAb不能有效活化補體的其中一個原因是腫瘤細胞抗原密度過低，以致于不能形成IgG二聚體，而此二聚體是C1q黏附及經典途徑活化所必需的。使用對于HER2/neu抗原上多個抗原決定簇特異性的mAbs的混合物可避免HER2/neu抗原密度的問題。此方法能在體外產生更有效的CDC并在體內增大腫瘤縮小的程度。對于其他mAbs，諸如humanized anti-vascular endothelial growth factor (VEGF; Bevacizumab)，關于補體活化的作用并未進行深入研究。

3.3 mCRPs作用 補體活化似乎并不是mAbs的重要效應機制，這是因為mCRPs在正常和腫瘤細胞的表達，使得它們對同源補體的攻擊具有高度的耐受性。在免疫逃逸中，腫瘤細胞通常過表達一種或更多種mCRPs[16]。對于mCRPs保護腫瘤細胞免于補體介導的效應機制的能力，已在體外多種腫瘤細胞系中進行了深入研究。這些研究表明，mCRPs對于mAb誘導的C3b沉積、C5a產生和MAC介導的裂解具有有效的抑制效應[17]。

據報道，每一腫瘤類型中都有某種特定的mCRP的過表達，從而針對一種mAb。體外實驗證實，通過腫瘤細胞表達的mCRPs，可抑制4種FDA批準的mAbs的CDC。CD55和CD59抑制補體介導的損傷，并且它們在腫瘤細胞的表達水平可決定體外mAbs對Ep-CAM和CD20的應答率[17]。這些數據表明mCRPs確實抑制了mAbs的治療作用。

體外實驗證實mCRPs在決定mAb免疫治療的作用，但僅有少數研究表明mCRPs在實驗動物腫瘤模型中的作用。由于mCRPs以物種選擇的方式起作用[18]，涉及不同物種的補體和mCRPs的異源動物模型可能在臨床上并不相關。例如，一種抗腫瘤的mAb可能在嚙齒動物的人腫瘤模型中有效，這是因為腫瘤細胞上表達的人mCRPs對于嚙齒動物的補體并不起作用。這樣將人的腫瘤與嚙齒動物的補體混合的方案，例如在裸鼠或severe combined immunodeficient (SCID)鼠上的人腫瘤，就可以解釋為什么相同的抗體在對鼠腫瘤有效而在臨床試驗環境下無效。因此，在進行mAb效應和mCRP表達作用的研究中采用同基因型的模型會更具有臨床相關性[19]。

然而，在同基因型模型中研究mCRPs對mAb的治療作用影響的數據很少。Di Gaetano等[20]報道了人B細胞淋巴瘤的小鼠模型，研究表明在此模型中，Rituximab的治療效果需要補體的活化。值得注意的是，嚙齒動物表達除了上述mCRPs以外的一種C3調節蛋白，Crry/p65 (Crry)[21]。Crry是嚙齒動物的主要C3調節蛋白。用人CD20轉染有轉移潛能的鼠EL4細胞，humanized anti-CD20 (Rituximab) and a murine anti-CD20 mAb 在野生型的同種基因的小鼠具有治療作用，而在C1q缺陷的同種基因小鼠不具有治療作用。另有報道使用種植表達大鼠Crry或CD59的人乳腺癌細胞的大鼠模型。結果表明，相對于空白對照轉染的細胞而言，Crry的表達可抑制宿主腫瘤的消退，而CD59的表達沒有作用[22]。盡管如此，在和大鼠CD59同源的人神經母細胞瘤的大鼠模型中，CD59的表達可促進腫瘤的生長[23]。在這些模型中，腫瘤細胞上的補體活化，通過大鼠抗腫瘤抗體自然產生，這些數據表明，在控制不同類型腫瘤的生長中涉及不同補體依賴的機制。

一些臨床研究表明，腫瘤細胞表達的mCRPs對免疫攻擊具有保護作用。在人腫瘤細胞中，CD55和CD46與嚙齒動物細胞中的Crry起著相同類型的補體抑制功能。CD55已被鑒定為腫瘤相關抗原，結直腸癌中高水平表達的CD55與生存的顯著下降相關[24]。在腎癌及宮頸癌組織中，CD46的低表達與C3的高水平沉積相關[25，26]。對anti-CD20 (Rituximab)治療反應較差的慢性淋巴細胞白血病患者(chronic lymphocytic leukemia，CLL)外周血分離的淋巴細胞，相對于anti-CD20 (Rituximab)治療有反應的患者，體外中和CD55和CD59后對于補體裂解更為敏感[27]。此外，在anti-CD20 (Rituximab)治療后，循環中未清除的CLL細胞上CD59的表達水平更高[28]。這些數據表明，mCRPs在抑制anti-CD20 (Rituximab) 治療的最佳臨床效果方面具有重要作用。然而，這尚有爭議。例如，已報道腫瘤細胞CD55和CD59的表達水平和裂解的百分比并無相關性[25]，并有另一項研究報道mCRP的表達水平并不能預測anti-CD20 (Rituximab)治療的臨床結果[27]。然而，這些報道的一致性在于證實補體，或是mCRPs，在anti-CD20 (Rituximab)的作用機制中的重要作用。補體相對于ADCC的確切機制目前尚不清楚。

總而言之，腫瘤實驗模型和臨床研究的數據表明，調節腫瘤細胞的補體易感性，對于增加mAb的治療效果具有潛在作用。

3.4 腫瘤細胞mCRPs的調節 可以通過改變同型或人源化的方法增加mAbs的補體活化能力，控制mCRP的功能也可使用直接針對抗腫瘤mAb的二級mAb或針對腫瘤細胞上沉積的iC3b的一級mAb 增加腫瘤細胞上mAb沉積的量，從而增加補體活化[29]。

mCRPs表達的下調可增強mAb介導的補體活化作用[30]。上調腫瘤抗原的表達水平也可導致補體活化增加。另一種抑制mAb誘導的補體活化中mCRPs作用的方法為，使用mAbs，封閉mCRPs的功能以增強腫瘤細胞對補體的易感性。然而，此方法在體內應用并不容易，這是因為在正常組織中，mCRPs的表達很廣泛。體外實驗表明，能識別腫瘤抗原和mCRP的雙特異性的mAb可選擇性靶向腫瘤細胞并增強它們對補體沉積和裂解的易感性[31]。在體內同基因型的大鼠模型中，這些雙特異性的mAbs能阻止腫瘤的生長。

綜上所述，可通過封閉或抑制mCRPs的功能以增強CDC使得補體系統有效清除調理腫瘤細胞的mAb。動物實驗及臨床試驗表明，調節mCRPs的功能可增加免疫治療mAbs的治療作用，不僅促進免疫治療的預期療效，并且增加臨床可用的mAbs的數目。闡明mAbs介導的腫瘤免疫治療的機制可使mAb的腫瘤治療作用達到預期，從而在許多情況下替代非特異性的化療。

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(2013-06-15收稿 2013-09-25修回)

(責任編輯 武建虎)

顧 勇，碩士，主治醫師， E-mail：wjyygy@126.com

710054西安，武警陜西總隊醫院消化內科

孟宏濤，E-mail：mhtmyt@163.com

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