蟲草菌絲對IL-1β誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡的保護作用與機制的實驗研究

鄭 倩,劉 華,曹弟勇,楊尚君,趙小蓉,米貴飛,趙雅茜,肖昊卓

(川北醫(yī)學(xué)院 1.機能實驗中心；2.藥理學(xué)教研室；3.寄生蟲學(xué)教研室；4.2012級臨床醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637100)

研究證實IL-1β是重要的內(nèi)源性細(xì)胞因子，其可通過影響NO[1]、Ca2+[2]、線粒體膜電位、ROS[3]以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[4]多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致糖尿病。蟲草菌絲(cordyceps sinensis,CS)是人工發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌絲，近年來其對糖尿病的防治作用受到了廣泛關(guān)注，我們前期工作采用IL-1β?lián)p傷離體乳鼠胰島細(xì)胞并用CS進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)CS可以增加乳鼠胰島細(xì)胞活性和分泌功能，其保護機制與降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，降低NO、ROS的生成以及提高SOD、GSH-PX的活性有關(guān)[5-6]。目前國內(nèi)外的研究證實解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP-2)可以通過影響ATP的生成、調(diào)節(jié)胰島素的分泌，抑制細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成，誘發(fā)胰島細(xì)胞的凋亡參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程，成為了研究的熱點。本研究探討CS對IL-1β誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞凋亡的作用以及機制是否與ROS水平和UCP-2表達有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

MIN6細(xì)胞購自上海拜力公司，CS(上海雅吉，A-0159)，IL-1β(invitrogen,792008D)，高糖DEEM，胎牛血清(hyclone,nzk0677)，Hochest33342，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(Beyotime,C1056)，活性氧檢測試劑盒(南京建成,A087)。熒光顯微鏡(Leica,德國)，熒光分光光度計(BIO-RAD,美國)，酶標(biāo)儀(BIO-RAD,美國)，流式細(xì)胞儀(Acuuri，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 選用第28～35代MIN6細(xì)胞為研究對象,MIN6細(xì)胞在含150 mL/L FBS、青、鏈霉素各10 U/mL的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。每2～3 d換液1次，5～6 d傳代1次，80%匯合時進行實驗。以每孔5×105mL/L細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，進行實驗分組。隨機分組：(1)正常對照組；(2)IL-1β(20 nmol/L)組；(3)IL-1β+低劑量CS1組；(4)IL-1β+高劑量CS2組，每組平行孔為6孔。正常對照組以含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，(2)～(4)組每孔細(xì)胞中各加入20 nmol/L的IL-1β作用24 h后，再分別加入不同濃度的CS(CS1：1 mmol·L-1，CS2：5 mmol·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進行各項檢測。

1.2.2 CCK8檢測細(xì)胞活性 將處理完畢的各組細(xì)胞用CCK8法進行檢測。方法如下：將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板離心(500 r/min×5 min)，然后吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，于細(xì)胞中加200 μL的培養(yǎng)液(不含小牛血清)和20 μL的CCK8，放入CO2孵育箱培養(yǎng)1 h后，在全自動酶標(biāo)儀上比色，測出每孔光密度值(OD值)進行比較，檢測波長為450 nm，OD值越高表明細(xì)胞活性就越強。

1.2.3 胰島素分泌量測定 各組待測標(biāo)本細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用Elisa試劑盒檢測胰島素的基礎(chǔ)分泌量；各組細(xì)胞中加入含16.7 mmol·L-1的葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h，離心提取上清液，按Elisa進行高糖刺激胰島素分泌量檢測。

1.2.4 Hochest33258染色檢測細(xì)胞凋亡 將10 μL Hochest33258加入培養(yǎng)的細(xì)胞中,終濃度為10 μg/mL,37 ℃孵育15 min，收集細(xì)胞，制成細(xì)胞爬片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核，了解細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 每個樣品收集約5×105mL/L細(xì)胞于1.5 mL離心管內(nèi)，離心棄上清。細(xì)胞沉淀用1 mL細(xì)胞染色緩沖液重懸，加入5 μL Annexin V-FIT和5 μL PI染色液，混勻，室溫避光孵育20 min，在1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測紅色熒光和藍色熒光。Annexin V-FITC+PI-象限為凋亡早期細(xì)胞；Annexin V-FITC-PI+為壞死細(xì)胞；Annexin V-FITC+PI+為凋亡晚期壞死細(xì)胞；Annexin V-FITC-PI-為活細(xì)胞。

1.2.6 Western blot檢測UCP-2蛋白含量 收集培養(yǎng)細(xì)胞，離心去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗2～3遍，用手指把細(xì)胞用力彈散，按每管細(xì)胞加入200 μL的比例加入裂解液，同時加入PMSF。用手指輕彈管底以促使裂解液和細(xì)胞充分接觸，用考馬斯亮藍法測定各細(xì)胞樣本蛋白含量。SDS-PAGE電泳半干轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，恒壓電泳，將電壓調(diào)至80 V使樣品通過濃縮膠與分離膠(電壓約8 V/cm)。電泳使染料至分離膠適當(dāng)位置，結(jié)束電泳。室溫封閉1 h，將一抗用封閉液稀釋(UCP-2抗體稀釋度均為1∶300，內(nèi)參抗體稀釋度為1∶1 000)；將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4 ℃反應(yīng)過夜；將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液(1∶3 000)中，室溫、避光緩慢搖動作用60 min；用1×TBST洗膜，曝光及洗片。用image J軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 胰島細(xì)胞活性的變化

與正常組對照組相比，IL-1β組光密度值OD值明顯降低，表明胰島細(xì)胞活性顯著下降(P<0.01)；加入低濃度和高濃度CS共同孵育可使OD值較損傷組均有不同程度的提高，具有顯著意義(P<0.05，P<0.01)，且有劑量依賴性(表1)。

表1 各組細(xì)胞光密度，基礎(chǔ)胰島素和高糖刺激胰島素分泌水平

*P<0.01，與對照組比較；#P<0.05，△P<0.01，與IL-1β組比較。

2.2 基礎(chǔ)和高糖刺激胰島素分泌量的測定

實驗結(jié)果見表1，IL-1β作用后胰島細(xì)胞胰島素基礎(chǔ)分泌量和葡萄糖刺激分泌量均顯著下降(P<0.01)，在IL-1β作用的基礎(chǔ)上與不同濃度CS共同培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞的分泌功能顯著增強，表現(xiàn)為基礎(chǔ)和高糖刺激的胰島素分泌增多，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

2.3 CS對MIN6細(xì)胞活性氧的含量的影響

IL-1β與胰島細(xì)胞作用后ROS活性增加，與正常組相比差異顯著(P<0.01)。與IL-1β組相比，經(jīng)CS共同孵育后，ROS的活性明顯降低，而且有劑量依賴性，高劑量組ROS的活性低于低劑量組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，實驗結(jié)果見表2。

2.4 CS對MIN6細(xì)胞凋亡的影響

正常組細(xì)胞呈均一藍色，且顏色偏淺。凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈致密濃染，亮度高，有的可見裂解的凋亡小體，IL-1β組凋亡細(xì)胞明顯增多，與CS作用后凋亡細(xì)胞減少(圖1)。采用流式細(xì)胞技術(shù)進行定量分析，檢測結(jié)果顯示對照組胰島細(xì)胞凋亡率為5.03±0.78；加入IL-1β作用后胰島細(xì)胞凋亡率顯著增加為24.5±0.65(P<0.01)；不同濃度CS作用均降低細(xì)胞凋亡率，高濃度CS作用后明顯降低凋亡率至9.08±0.36(P<0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(表2，圖2)。

表2 細(xì)胞凋亡率、ROS和UCP-2蛋白的表達

*P<0.01，#P<0.001，與對照組比較；△P<0.05，▲P<0.01，□P<0.001，與IL-1β組比較。

2.5 CS對IL-1β作用的MIN6細(xì)胞UCP-2蛋白相對含量的影響

由圖3，表2可知，加入IL-1β作用后胰島細(xì)胞UCP-2蛋白相對含量表達明顯下調(diào)，與正常組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；與不同濃度CS共同孵育后，UCP-2蛋白含量上調(diào)，高于IL-1β組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

MIN6細(xì)胞系是胰島素啟動子控制下表達SV40大T抗原的小鼠胰島腫瘤的細(xì)胞系，葡萄糖刺激的胰島素分泌強度與正常的胰島β相似，因此常被用來研究胰島β細(xì)胞的功能。本研究結(jié)果表明，IL-1β在體外環(huán)境能誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡，通過熒光染色和流式細(xì)胞技術(shù)可以證實凋亡的存在。多項研究[7-9]表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能衰退的重要因素，ROS可直接損傷β細(xì)胞，特別是破壞細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)，促進β細(xì)胞凋亡。UCP-2是線粒體內(nèi)膜上解偶聯(lián)蛋白家族成員之一，其廣泛存在脾臟、下丘腦、胰腺、心臟和肺等多種組織中，能通過質(zhì)子漏作用，使線粒體內(nèi)膜外的質(zhì)子直接進入線粒體基質(zhì)，降低了內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子電化學(xué)梯度，使氧化過程與二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)磷酸化過程解偶聯(lián)，從而使ATP合成減少，能量以熱能的形式釋放，同時由于內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子電化學(xué)梯度降低，呼吸鏈上的電子回漏減少，使ROS生成減少。UCP-2可以通過降低ROS的生成降低凋亡的生成從而保護細(xì)胞功能。

有研究發(fā)現(xiàn)小鼠胰島和INS-1E細(xì)胞系中有UCP-2的表達[10-11]，本實驗結(jié)果提示MIN6細(xì)胞亦有UCP-2的表達。IL-1β作用MIN6細(xì)胞后ROS明顯增加，同時UCP-2的表達降低，證實IL-1β引起MIN6細(xì)胞凋亡途徑與UCP-2蛋白表達降低，ROS水平增加有關(guān)。多篇文獻報道IL-1β可以下調(diào)UCP-2的表達[12-13]，與本研究類似，也有研究得到不同的結(jié)果，Luo[14]觀察到IL-1β可以上調(diào)INS-1細(xì)胞中UCP-2的表達，可能與采用的細(xì)胞以及使用的劑量有關(guān)，值得進一步深入研究。

細(xì)胞凋亡在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用，阻斷胰島細(xì)胞凋亡可降低糖尿病的發(fā)生，因此抑制凋亡的藥物篩選成為研究的熱點。

蟲草菌絲是本課題組篩選的對胰島細(xì)胞具有保護作用的藥物，前期的研究證實蟲草菌絲對IL-1β?lián)p傷的胰島細(xì)胞有保護作用，其保護機制與降低NO和Ca2+濃度以及提高CO/HO系統(tǒng)活性有關(guān)，但是其對MIN6細(xì)胞凋亡的保護機制研究并未涉及。本實驗證實，CS可以降低IL-1β誘導(dǎo)的MIN6胰島細(xì)胞凋亡，凋亡率顯著降低，同時細(xì)胞活性增強，胰島素的分泌功能增加，說明其對IL-1β誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞凋亡有保護作用。并且通過Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞UCP-2蛋白的表達增加，ROS水平降低，說明其降低凋亡保護細(xì)胞功能的機制可能與增加UCP-2的表達，降低ROS的生成有關(guān)，有效地清除自由基，改善氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少胰島細(xì)胞的氧化損傷。本研究為尋找2型糖尿病的中藥治療打下了理論基礎(chǔ)，同時為2型糖尿病的治療提供新的思路與臨床用藥篩選，不過CS對2型糖尿病的保護作用機制仍然需要進一步研究。

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