戊巴比妥鈉在2型糖尿病大鼠模型復制中的應用研究

劉 華，劉行海，馮 乾，張 婷，買文麗，蘭海濤，鄭 倩，劉 紅

(川北醫學院生理學教研室，四川 南充 637100)

中國是世界上糖尿病患者最多的國家，目前患病人數已經超過9 200萬[1]，每年全球有大約300多萬人死于糖尿病，有600多萬人成為新的糖尿病患者[2]。所以，對糖尿病的研究任務仍然緊迫而艱巨。因為糖尿病模型對糖尿病的基礎研究具有重要的實用價值，因此近年來成為該領域的研究熱點。

目前，國內外廣泛使用“高脂飼養+小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)”的方法誘導糖尿病大鼠模型[3-4]。在長期實驗中，我們發現這種造模方法仍然存在一些明顯的缺陷，主要體現在：(1)造模成功率不高，一般只能達到50%左右；(2)動物模型穩定性差，2～4周后部分模型自愈轉陰，部分模型由于血糖持續升高而死亡；(3)復制的同批次模型大鼠個體間血糖值差異性較大；(4)如果采用STZ連續3～5 d注射，雖然可以提高成模率，但是遠期動物死亡率和批量復制費用也會顯著增加[5-6]。本實驗通過在動物一次性注射小劑量STZ前給予戊巴比妥鈉預處理，使全部動物在STZ作用的有效期內都處于相似的機能狀態，從而盡量避免上述缺陷和提高糖尿病模型質量。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

雄性Wistar大鼠50只，清潔級，重量180～200 g。動物及飼料均由川北醫學院醫學實驗動物中心提供。STZ與戊巴比妥鈉均為Sigma公司產品，膽固醇與豬膽酸鹽購自南京生化制藥廠，血糖測定儀為長沙三諾科技公司產品。高脂飼料配方：常規飼料65%，12%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，0.5%豬膽酸鹽。

1.2 動物模型建立與分組

全部實驗大鼠分為三組：正常對照組(N組)，n=10；模型復制對照組(C組)，n=20；實驗觀察組(T組)，n=20。N組全程常規飼料喂養，腹腔注射時用等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為對照處理；C組高能飼料飼養4周后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg(STZ臨時用0.1 mol/L，pH=4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成0.3%的終濃度)，繼續高能飼料飼養4周；T組用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后再給予STZ，其余處理同C組。在STZ注射后第2、4、6、8周末采尾靜脈血測定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和體重，以FBG>7.8 mmol·L-1作為T2DM模型的判斷標準[7-8]。在STZ注射后第8周末，斷髓處死動物，迅速摘取每組動物胰腺組織和肝臟組織放入10%甲醛溶液中固定后用于常規病理切片并行HE染色。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 STZ注射后各組大鼠FBG和體重的變化

C組大鼠和T組大鼠在STZ注射后血糖逐漸升高，注射4周后，兩組大鼠體重呈現逐漸下降趨勢。C組動物病情呈分化狀態，部分動物血糖逐漸下降，恢復正常，部分動物病情持續加重，甚至死亡。與C組比較，T組大鼠血糖在STZ注射后第2、4、6、8周均有統計學差異(P<0.01)，STZ注射后第8周實驗觀察組大鼠體重有統計學差異(P<0.01)，其余各時期比較體重無統計學差異(P>0.05)。結果見表1。

表1 STZ注射后各組大鼠血糖和體重的變化

*P<0.01，與C組相應時間點比較。

2.2 STZ注射后各組大鼠各時期成模率和死亡率比較

由表2可見，各時期比較：T組大鼠成模率均顯著高于C組(P<0.01)，而死亡率顯著低于C組(P<0.01)。第4周兩組大鼠成模率均最高。與C組比較，第6、8周T組大鼠死亡率有統計學差異(P<0.01)。T組動物實驗全程均無死亡。

表2 STZ注射后各組大鼠成模率和死亡率比較

*P<0.01，與相應對照組比較；#P<0.01，與4周C組比較；△P<0.01，與6周C組比較。

2.3 實驗大鼠胰腺、肝臟組織病理學改變

實驗復制的2型糖尿病模型大鼠，胰腺組織病理切片觀察，鏡下胰島少見，形態不規則，邊緣不整齊，胰島中內分泌細胞數量明顯減少，細胞界限不清，個別胰島內呈空泡樣改變(圖1，T組取材)。肝細胞疏松，脂肪樣變性及灶性壞死，匯管區及肝竇可見炎細胞浸潤，肝索排列紊亂，肝竇變窄(圖2，T組取材)。

3 討論

創建一種經濟適用、穩定性好、重復率高、遠期死亡率低的糖尿病造模方法對糖尿病研究具有重大而現實的意義[9-10]。近年來，國內外對糖尿病動物模型的研究十分活躍，使用高脂誘導動物產生胰島素抵抗，再用小劑量STZ選擇性損傷大鼠部分胰島B細胞，使胰島素合成相對減少的造模方法被廣泛采用[11-12]。但是，這種造模方法在STZ的用量與用法上，動物成模率與穩定性等方面各研究者的報道差別很大。2008年劉亞平等[13]報道，STZ 30 mg/kg，3周后再次注射30 mg/kg；2009年王玉忠等[14]報道，STZ 30 mg/(kg·d)，連續3 d注射；2011年申彥菊等[15]報道，STZ 30 mg/(kg·d)，連續5 d注射；2011年王嘉惠等[16]報道，STZ 45 mg/kg；2012年薛紅麗等[17]報道，STZ 35 mg/kg。在STZ單次用量上，從15 mg/kg至45 mg/kg均有報道，一次模型復制總用量從15 mg/kg至150 mg/kg均有報道，成模率報道從50%至80%不等。

實驗中C組大鼠采用我們以往的2型糖尿病復制方法[18]，T組大鼠采用高脂+戊巴比妥鈉+STZ的方法復制。實驗結果表明，T組大鼠在STZ注射后第2周開始血糖平均水平就顯著高于C組大鼠，成模率也比C組大鼠高15%，提示該方法可能縮短成模周期。兩組大鼠都在STZ注射后第4周成模率達到高峰，但T組大鼠成模率高達90%，顯著高于C組的60%。STZ注射4周后C組大鼠成模率明顯下降，部分大鼠由于血糖水平太高，造成糖尿病酮癥酸中毒死亡，部分大鼠血糖水平發生自然恢復，而T組大鼠成模率無明顯下降，說明在模型穩定性方面，T組大鼠要高于C組大鼠。從結果中的表1看，C組大鼠血糖平均水平的標準差明顯高于T組大鼠，說明T組大鼠組內血糖差異度要小于C組大鼠。對T組實驗大鼠胰島與肝臟組織進行病理學觀察，低倍鏡下胰島分布少見，形態與邊緣改變，高倍鏡下島內細胞數量下降，個別甚至呈空泡樣改變；肝細胞疏松，脂肪樣變性，匯管區及肝竇炎性病變。這些病理變化也與糖尿病病理吻合，進一步證明了模型的可靠性。

從上述結果分析，“高脂飲食+戊巴比妥鈉+小劑量STZ”的2型糖尿病造模方法，與目前研究者廣泛采用的“高脂飲食+小劑量STZ”的造模方法比較，相對優勢為：大幅提高了造模成功率，降低了造模成本，縮小糖尿病模型個體之間的病理差異，提高模型的穩定性，降低后期轉陰率和死亡率，使模型更接近于人類糖尿病的病生病理。戊巴比妥鈉在新的造模方法中可能具有以下一些作用：(1)改變了給藥方法，由單一給藥改為聯合給藥，通過協同效應增強藥物的作用效果，降低了STZ用量；(2)統一給藥后狀態，由活動狀態給藥改為麻醉狀態給藥，統一了STZ作用時的動物機能狀態，縮小了模型之間的病理差異；(3)降低了STZ作用時動物的機能，延緩了STZ的代謝，從而增加了STZ的有效作用時間。

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